免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。本文介绍了免疫共沉淀的实验原理、优缺点以及Co-IP的实验设计、基本步骤。

免疫共沉淀（Co-IP）实验原理

    当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定--种特定蛋白质的新的作用搭档。

免疫共沉淀基本原理

免疫共沉淀（Co-IP实验）优缺点

优点	缺点
①相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态;	①可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用;
②蛋白质的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响;	②两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用;
③可以分离得到天然状态的相互作用的蛋白质复合物。	③必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

免疫共沉淀实验设计和基本步骤

1.需要的设备

    4℃离心机，4℃旋转仪，超声仪。

2.准备的试剂

    (1)预冷PBS

    IP缓冲液，分低、中、高盐三种配方:

IP buffer	高	中	低
1mol/L Tris pH 8.0	8mL	8mL	8mL
5mol/L NaCl	40mL	20mL	10mL
NP-40	4mL	2mL	0.5mL
0.5mol/L EDTA	4mL	4mL	4mL
H2O	344mL	366mL	377.5mL

其他1mmol/L DTT，蛋白酶抑制剂(1 : 1000) 现加。

3.实验设计

    免疫共沉淀可分为检测目的蛋白为两种外源蛋白，一种外源蛋白和一种内源蛋白，两种内源蛋白三种情况。

    (1)两种外源蛋白的免疫共沉淀

    即两种蛋白质均由真核表达获得，其基本步骤如下。

    ①两种待检测相互作用的蛋白质义，Y，分别构建在不同标签的真核表达载体上，如带FLAG标签的pcDNA3. 1 (FLAG-Xp、 带myc标签的pXJ-40 (Myc-Y) 上，将其共转染293T细胞。

    ②24~48h取出样品,(去培养基，1mL PBS洗。

    ③0.5mL PBS吹下细胞，再用0. 5mL PBS吸出残余细胞至同一管，3000r/min 离心3min，去上清。

    ④IPbuffer0.5mL(含0.5pL蛋白酶抑制剂和0.5μL1mol/LDTT)混匀细胞，冰上30min，用注射器吹打细胞至少5次或超声破碎(将DNA破坏)，12000r/min 4℃离心10min。

    ⑤取上清， 取30μL 至另一管中加等体积2XSDS作Input，-20℃保存。

    ⑥Flag/Myc beads用lmL IP缓冲液平衡4次，去上清，用相同体积的IP缓冲液混匀beads。

    ⑦取30μLbeads至④上清中，于4℃结合4h以上。

    ⑧3000r/min 4℃离心3min,去上清。用IP缓冲液洗4次，4℃旋转洗10min，3000r/min 4℃离心3min收集珠子，用等体积2X SDS轻轻混匀后-20℃保存或与Input同时煮10min后离心，行SDS-PAGE与Western Blot分析或质谱分析。

(2)一种外源蛋白和一种内源蛋白的免疫共沉淀

    即一种蛋白质为外源表达获得，另一种蛋白质为细胞内源所有。其基本步骤如下。

    ①将一种待检测蛋白质构建在带标签的真核表达载体上，如带FLAG标签的pcDNA3.0 (FLAG-X)，带myc标签的pXJ-40(Myc-X)或HA标签的pcDNA3.0(Myc-X)，将其转染293T细胞。

    ②24~48h取出样品，去培养基，1mL PBS洗。

    ③0.5mL PBS吹下细胞，再用0.5mL PBS吸出残余细胞至同一管，3000r/ min离心3min，去上清。

    ④IP缓冲液0.5mL(含0.5μL蛋白酶抑制剂和0.5μL1mol/LDTT)混匀细胞，冰上放置30min,用注射器吹打细胞至少5次或超声破碎(将DNA破坏)，12000r/min 4℃离心10min。

    ⑤取上清，取30μL至另一管中加等体积2XSDS作Input，-20℃保存。

    ⑥Flag/Myc/HA珠子用1mL. IP缓冲液平衡4次，去上清，用相同体积的IP缓冲液混匀珠子。

    ⑦取30μL珠子至④上清中，于4℃结合4h以上。

    ⑧3000r/min 4℃离心3min,去上清。用IP缓冲液洗4次，4℃旋转洗10min, 3000r/min 4℃离心3min收集珠子，用等体积2XSDS轻轻混匀后-20℃保存或与Input同时煮10min后离心，行SDS-PAGE, Western Blot分析或质谱分析。

(3)两种内源蛋白的免疫共沉淀

    即两种蛋白质均为生理状态下细胞内源蛋白，其基本步骤如下。

    ①细胞去培养基，1XPBS洗一遍，1mL 1X PBS收集细胞，3000r/min 离心3min,弃上清。

    ②0.5mL IP缓冲液重悬，冰浴30min，超责破碎，12000r/min 离心10min， 取上清30μL作Input,约420μL上清进行免疫沉淀。

    ③50pL protein A或G封闭1h，3000r/min 离心2min,取上清。

    ④加入抗体: 4μg (20μL) 或Normal IgG (1μL)， 4℃结合4h或过夜。

    ⑤加入protein A或G 50pLZ4℃结合1h。

    ⑥IP缓冲液洗4次(后3次每次30min)，3000r/min 离心2min，弃上清。

    ⑦加裂解液(2X SDS)30μL，沸水煮10min，行SDS-PAGE与Western Blot分析或质谱分析。

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