免疫共沉淀（Co-IP实验）步骤

1　 用磷酸盐缓冲液洗 30块 10 cm培养板上的适宜细胞。 刮去每块板上的细胞到 1 ml冰冷的 EBC裂解缓冲液中。

2　 将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中, 在微量离心机上 4 ℃以最大速度离心 15 min。

3　 收集上清 (约 30 ml)并加入 30 μg的适当抗体, 4℃摇动免疫沉淀物 1 h。

4　 加入 0.9 ml的蛋白质 A-Sepharose悬液, 4 ℃摇动免疫沉淀物 30min。

5　 用含 900mmol/LNaCl的 NETN洗蛋白 A-Sepharose混合物, 再重复洗 5次。 最后, 用 NETN洗 1次。

6　 吸出混合物的液体部分。 加入 800 μl的 1 ×SDS胶加样缓冲液到球珠中, 煮沸 4 min。

7　 将样品加入到大孔的不连续 SDS-PAGE梯度胶中,在 10mA的恒定电流下电泳过夜。

8　 通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9　 从胶上切下目标带 , 将其放到微量离心管中, 用 1ml 50%乙腈洗两次, 每次 3min。

10　 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质, 再将肽电洗脱。

11　 通过窄孔高效液相色谱分离肽。 将收集的肽在 ABI477A或 494A机器上进行自动 Edman降解测序。

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