SYBR Green I方法

    SYBR Green I方法是目前最为常见的荧光染料，其作用原理为：SYBR Green I是一种只与双链DNA小沟结合的染料，并不与单链DNA链结合，而且在游离状态不发出荧光，只有掺入DNA双链中才可以发光，因此，在PCR体系中，随着特异性PCR产物的指数扩增，每个循环的延伸阶段，染料掺入双链DNA中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关（见图1-1）。基于SYBR Green I染料法的荧光定量PCR的最大优点是通用性强，适用于所有的荧光定量PCR反应，同时，其缺点也在于其非特异性。当PCR反应中有引物二聚体或者非特异性扩增时，该染料也可以和这些非特异性扩增产物结合，发出荧光，从而干扰对特异性产物的准确定量。但是通过对PCR产物的熔解曲线进行分析，使非特异性扩增的问题得以解决，从而保证荧光信号的特异性。Tm值得概念：Tm为DNA解链一半时的温度，不同的双链DNA由于其碱基组成不同，长度不同，因此Tm值也不同，据此可以判断是否获得同一PCR产物（见图1-2），当非特异峰Tm＞特异峰Tm时，一般为非特异扩增，当非特异峰Tm＜特异峰Tm，或者在72℃左右时，一般为引物二聚体，当然最后要依据琼脂糖电泳的结果进行验证。

    在PCR过程中，SG染料只有在延伸阶段形成双链时，才通过和双链DNA的小沟结合，在激发情况下发出荧光，在变性和退火的单链状态时，不能发出荧光。荧光量与产物中双链的量呈正相关。

    结合有染料的双链DNA随温度的升高逐步解链后不再结合染料，因此，荧光强度（纵坐标）随温度（横坐标）的升高而减弱。将温度与荧光强度的变化求导（-dI/dT），即得Tm值，对应图中的熔解曲线峰图。左图表明产物的特异性，右图熔解曲线分析出现非特异峰，说明有引物二聚体或者非特异扩增，导致定量不准确。

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