DNA酶I足迹分析法

　　本分析方法用来检测DNA上特异的蛋白质结合位点。位点上结合的蛋白质可保护DNA的磷酸二酯键骨架免于受DNA酶I催化的水解。水解后DNA片段在变性DNA测序胶上分离，通过放射自显影可使结合位点显示出来。足迹法已进步发展成为确定DNA上每个蛋白质结合位点各自的结合曲线的定量技术。对F有协同作用的位点，可对它们的结合曲线进行联立数值分析，从而分解出固有结合及协同组成。本文介绍DNA酶I足迹滴定的方法。

实验材料

含有DNA结合位点的质粒DNA	适当的限制性内切核酸酶
100%乙醇及冰冷的70%乙醇	TE缓冲液
[α-32P] dNTP (3000~6000 Ci/mmol)水溶液	10X Klenow片段缓冲液
E. coli DNA聚合酶I的Klenow片段	5 mmol/L 4dNTP混合液
脱氧核糖核酸酶I (DNA酶I; EC3. 1.4.5)	分析缓冲液A或B
DNA酶1终止缓冲液	DNA酶I储存缓冲液
甲酰胺加样缓冲液	10 ml一次性塑料
硅烷化1.5 ml微量离心管	可调节水浴锅(±0.1℃)
12 inX7.5 in大小的玻璃或不锈钢碟	有盖子的塑料微量离心管
6mm宽间隔12mm的DNA测序胶梳	平头Hamilton注射器(29-G, 用于0.4 mm胶)

　　

实验步骤

　　1)用限制性内切核酸酶消化约5pmol质粒，使得在距第1个蛋白质结合位点25~100bp处产生一个3'凹端(图1)。

　　

　　 　　图1蛋白质结合位点距产生线性单末端标记片段的限制性内切核酸酶切口的正确定位。黑色盒子代表蛋白质结合位点。星号(*)代表Klenow标记反应中[32P] dNTP的掺人。
　　 2) DNA用乙醇沉淀，用1 ml冰冷的70%的乙醇洗1次，在Speedvac真空旋转蒸发器中干燥。DNA沉淀重溶于5 μl TE缓冲液中。
　　 3)加入适当的[32P] dNTP水溶液，每种各50 pCi,再加人5 μl 10 X Klenow酶缓冲液，加水至49μl.加1 μl Klenow酶(5~10 Kunitz单位)，轻轻混合并离心,室温温育25 min。
　　 4)加2μl 5mmol/L 4dNTP混合液，混匀，温育5 min。
　　 5)用离心过柱法除去未掺人的核苷酸。DNA如步骤2一样用乙醇沉淀。
　　 6)用第二种限制酶消化，产生仅在一条链及个末端上标记的限制性片段，切点位于最远离标记末端的蛋白质结合位点>150 bp (图1)。
　　 7)用琼脂糖凝胶电泳，随后用电洗脱及反相层析法纯化含有结合位点的标记DNA。
　　 8)如步骤2一样用乙醇沉淀DNA。将DNA溶解于100 μl pH8.0的TE缓冲液中。在4℃保存，不要冻结。
　　 9)取0.5 μl DNA溶液放人水性闪烁液中计数，以测定DNA的放射性。
　　 10)在10 ml一一次性塑料管中准备(n+2)X180 μl分析缓冲液，其中n为实验中结合反应的份数。计算达到10 000~15 000 cpm/泳道的³²P标记的DNA的体积。加人³²P标记的DNA,轻轻在涡旋混合器上振荡混匀。
　　分析缓冲液的成分(如A或B)取决于蛋白质的性质、蛋白质DNA系统以及所要解决的问题。DNA酶I的活性需要有微摩尔浓度的Mg²⁺Ca²⁺存在。
　　 11)将含有³²P标记的DNA的分析缓冲液按180 μl/管分装人n+1个1.5 ml硅化的微量离心管中，多余的1个管作为不加DNA酶I的对照。
　　 12)对蛋白质进行系列稀释以覆盖所要分析的浓度范围。
　　 　　结合蛋白的浓度范围应达到能覆盖所有蛋白质结合位点饱和度的0~99%，并且应以等间隔浓度的对数值表示，至少要有几个点用来确定滴定曲线的浙近线(图2)。
　　 　　

　　 　　图2显示适当范围和间隔的蛋白质浓度的足迹法滴定曲线。滴定曲线的上限和下限用虚线标示。f值的定义见辅助方案1。
　　 13)根据需要取2~20 pl稀释的蛋白质溶液加入各管中。加分析缓冲液(不含P标记的DNA)至终体积200 μl/管。
　　 14)轻轻混合，稍加离心，在所需温度的水浴中平衡30~45 min。
　　 15)准备过量的DNA酶I终止液(700 μl/管)，置于干冰/乙醇浴中。
　　 16)准备≥500 μl用无BSA及小牛胸腺DNA的分析缓冲液稀释的DNA酶1溶液。将它同样品-起置于调节好水温的水浴中平衡。
　　 17)准确吸取5 μl稀释的DNA酶1加入第1管样品中，轻柔且迅速混合，马上放回水浴中。将定时钟设置为2 min。
　　 18) 刚好2 min后，迅速加入700 ul DNA酶I终止液。在涡旋混合器上剧烈振荡混匀，将管置于干冰/乙醇浴中。
　　 　　DNA酶I作用的时间和浓度可作改变(在各次实验之间，但不要在同次实验之中)， 只要二者的产物(即产生的DNA切口的数量)保持恒定。作用总时间不成为问题。
　　 19)每管都重复步骤17和步骤18的过程。
　　 20)在步骤11准备的对照管(不含DNA酶D中加终止液。
　　 21)在干冰/乙醇浴中沉淀DNA 15 min以上。当最后-管放人之后开始计时。
　　 22)离心15 min,用移液管小心移去上清。加1 ml预冷的70%乙醇，离心5 min。用移液器小心吸掉上清，因为此时沉淀很松散地接触在管壁上。重复洗1次。在Speedvac真空旋转蒸发器中干燥沉淀(10~15 min)。
　　 23)将DNA重悬于5μl甲酰胺加样缓冲液中:在试管的内表面上方滴出缓冲液，拍打试管使缓冲液沉下。涡旋混合器上剧烈振荡，离心几秒钟。重复两次。
　　 24)如果不马上进行电泳分析，可将样品保存在一70过夜。
　　 25)制备聚丙烯酰胺DNA测序胶并预电泳。
　　 26)在预电泳时，将样品置于干热式电加热块中90℃加热5~10 min,立即浸入冰水中。当凝胶温度达到50~55℃时，切断电源，小心加样，确定吸完所有管中的加样缓冲液。
　　 27)电泳至蛋白质结合位点移至胶的中部或略下。用标准方法固定(只对梯度胶)和干胶。
　　 28)凝胶用经预闪处理的Kodak X Omat AR胶片及单块钨酸钙增感屏在-70~-85℃放射自显影。使胶片预闪处理过的面对着凝胶。每块凝胶做2~3张自显影片(不同的曝光水平)以确保合适的曝光。
　　 29)在相同的条件下冲洗胶片。
　　 30)小心保存胶片，胶片之间插入纸片。划痕、指纹、污垢产生的光学信号很难与P区分。用放射自显影图作定量分析。

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