Co-IP技术服务案例

1、实验设计

用预先固化在argarose beads上的Protein A的抗体免疫沉淀A蛋白，与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者间的相互作用。

2、试剂和耗材

样品：(1). HEK293未转染细胞
   (2). 对照组pcDNA3.1-flag +pcDNA3.1-xx
   (3).实验组pcDNA3.1-3D-Flag+pcDNA3.1-xxx

名称	公司	名称	公司
抗体：Flag，cMyc	钟鼎生物	Protein Marker	钟鼎生物
Acr、Bis、Tris	Sigma公司	SDS	Amresco公司
TEMED	BIO-RAD公司	其它试剂均为国产分析纯

3、主要实验仪器

仪器名称	公司	仪器名称	公司
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机	美国BECKMAN公司	台式高速离心机	德国SORVAL公司
Gel Doc2000成像系统、垂直电泳系统	美国BIO-RAD公司	320-S pH计	美国Mettler Toledo公司
AR5120电子天平	美国AHOΜS公司	MultiTemp III 恒温水浴锅 雪花状制冰机	日本SANYO公司
超净工作台	中国苏净集团	NANODROP2000	Thermo公司

4、实验步骤

4.1、样品制备

(1) 取样品依次加入适量的裂解液混匀，在冰上充分裂解。
(2) 将细胞裂解液转移到 1.5 ml EP管内，于冷冻离心机 4℃，12000 rpm 离心 10 min。
(3) 将离心后的上清液分为两份：一份 40 μl，加入10 μl 5×SDS sample buffer, 混匀后于100℃煮 10 min，作为总细胞裂解液于－20℃保存，Western blot 检测目的蛋白的表达水平。

4.2、免疫沉淀

(1) 各取30 μl Protein A置于离心机2000 rpm 弃上清，在用PBS洗涤2次。加入300 μl细胞裂解液4度旋转仪4h（消除样品中非特异性结合的影响）。
(2) 4℃，4000 rpm 离心 5 min，弃去沉淀，保留上清。
(3) 上清中加入已经平衡10 μl 抗体A，置于4℃旋转仪上旋转4 h，让抗原a和抗体A充分结合。
(4) 加入30 μl已经平衡好的 Protein A置于4℃旋转仪上旋转4 h，让抗原a和抗体A复合物与protein A充分结合。
(5) 离心，弃上清。沉淀用PBS洗3遍。
(6) 用PH1.5甘氨酸50 μl在冰上洗脱混匀20 min。
(7) 离心10000 rpm 2 min取上清为免疫复合物洗脱液，加入5×SDS sample buffer混匀后 100℃煮10 min。用于后续SDS-PAGE电泳或Western blot检测。

4.3、Western Blot 检测

(1) 取总细胞裂解液，加loading buffer煮沸冷却后上样。
(2) 电泳条件：4%浓缩胶：90 V, 30 min； 15%分离胶：120 V, 90 min。
(3) 电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒流250 mA转膜，约为1h。
(4) 电转结束后，取下膜后先用PBST洗涤4次，每次5 min。
(5) 将膜置于5%脱脂奶粉封闭液中封闭37℃ 1 h。
(6) 用PBST稀释一抗，膜在一抗稀释液中4℃过夜。
(7) 次日将膜取出后用PBST 洗膜4次，每次5 min。
(8) 用含5%脱脂奶粉的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1 h。
(9) 反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5 min。
(10) ECL显影，曝光。

5、实验结果

编号	抗体名称	稀释比例	二抗名称	稀释比例
1	Flag	1：1000	羊抗鼠	1：5000
2	cMyc	1：5000	羊抗鼠	1：5000

 

蛋白互作验证

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