非生物胁迫文库构建及筛选

一、胁迫条件筛选基因理论基础

非生物环境条件的变化，例如低温/高温、干旱/洪涝、强光/弱光、高盐/低盐、重金属、农药、二氧化硫污染等。这种不利于植物生存和生长发育甚至导致伤害或死亡的非生物的环境条件，我们称之为非生物胁迫。

胁迫环境下，潜藏在生物体内的“超能力”基因会被激发，从而赋予了生物体内对外界胁迫能力的适应性，这些具备“超能力”基因的“超级英雄”，正是我们要解码的对象。

不同的环境胁迫会引起植物在基因表达、代谢和生理性状等方面的特异的反应。因此可以推测，植物细胞能够感知不同的环境信号。尽管关于胁迫的研究很多，目前也只发现了少数几个胁迫感受器。究其原因，大致如下：

1、感受蛋白的功能冗余，即一个感受蛋白的缺失并不导致胁迫应答的显著变化。另外一种情形是，某个感受器可能是植物生长必需的，而功能缺失突变体将不会存活，致使无法对其深入研究。

2、很难从技术上证明一种蛋白质或其他大分子是物理信号(如渗透压的变化、离子浓度或温度)的感受器。这导致即使对于一些被广泛承认的细菌、酵母或者哺乳动物的渗透或温度受体，也缺乏这些受体直接感受渗透或温度等物理信号的实验证据。（本观点来自于植物逆境生物学研究泰斗朱健康院士在Cell杂志上发表了题为“Abiotic stress signaling and responeses in plants” ）

系统性胁迫信号转导模型

二、技术流程


通过对不同的生长时期、不同组织部位采样，提取足量丰富的RNA，我们可以获得高覆盖率cDNA，将这些携带三框接头的cDNA通过Gateway重组技术连接在pYES2-LR载体上，转化环境敏感性的酿酒酵母菌株，通过非生物胁迫处理，只有被赋予“超级能力”的酵母菌才能存活，从而筛选到与胁迫处理高相关性的“超能力基因”。

技术流程图


三、技术优势

跨时空取材，起始RNA量300ug，分离mRNA后酶促法反转录获得cDNA，均一化剔除高拷贝基因干扰

添加三框接头，确保每一个cDNA都有正确的表达框，不遗漏功能蛋白

利用Gateway重组技术，高效率链接cDNA重组进表达载体pYES2-LR，连接效率大于99%

电转化设备+多种敏感型酵母菌株备选，NvSC1（标准型）BY4741(温度、盐敏感型)， R5421（钾离子缺陷型）

四、pYES2-LR载体信息

本项目使用pYES2-LR载体是基于pYES2改造，保留了pYES2的基本元件，添加了LR同源重组臂以及筛选基因，可以使用gateway初级质粒重组构建次级文库。


pYES2-LR载体图谱



五、案例展示

1.干旱胁迫案例

干旱胁迫处理案例

2.盐胁迫案例

盐胁迫处理案例

六、文章简介

1.文献：Two novel transporters NtNRAMP6a and NtNRAMP6b are involved in cadmium transport in tobacco (Nicotiana tabacum L.).

作者研究的是两个新型转运体NtNRAMP6a和NtNRAMP6b参与烟草的镉转运。为了评估这两种蛋白的金属转运功能，将它们异源表达在不同的酵母菌株中。结果显示NtNRAMP6a和NtNRAMP6b显著的提高了 镉敏感突变酵母(Δycf1)对镉的敏感性，表明NtNRAMP6a和NtNRAMP6b在酵母中具有镉转运功能。

镉胁迫案例图片

七、方法学评价

  • 优势：
    1、通过胁迫条件快速确认胁迫相关靶基因，实验流程简单，操作方便。
    2、初级文库与酵母单双杂文库通用，构建胁迫成本低廉。
    3、表型与靶基因高度相关，已有多篇高水平论文验证其原理可行。
  • 劣势：
    1、敏感性酵母菌株可选种类较少，限制该方法的使用范围。
    2、对于多基因参与的胁迫应答，无法明确其作用机理，还需进一步论证。
    3、筛选到靶基因后，下游验证工作量偏大。


热门栏目您可能对以下内容感兴趣：

基因功能研究整体解决方案 酵母双杂交检测服务 酵母单杂交技术