1、噬菌体环十肽文库的制备及鉴定

1.1随机环十肽核苷酸的合成

编码随机环十肽核苷酸片段的设计策略同前文环九肽一致，采用(NNK)10编码方式，其中编码随机环十肽核苷酸序列的前两个核苷酸为任意核苷酸N(A/T/C/G)，最后一个核苷酸根据密码子的简并性设计为K(G/T) 。根据载体上Sfi I、Not I酶切位点情况及构建随机肽库的要求，设计一条环十肽寡核苷酸片段链1及两条扩增引物正向引物F和反向引物R。链 1: 5'- GTTGTTCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTGTGCGGCC
GCAGGTGCGCCGGTGCCGTAT-3'，在 5'和 3'端 引入Sfi I、Not I酶切位点，用下划线表示; F: 5'- GTTGTTCCTTTCTATGCGGCCCAGC -3'，R：5'- ATACGGCACCGGCGCACCTG -3'。正向引物F和反向引物R能够分别与链1的5'和 3'端部分结合从而进行双链DNA的扩增。用灭菌去离子水将合成的DNA干粉溶解，得到浓度为10 µmol/L 的溶液，分装后于-20 ℃冻存。

1.2随机环十肽寡核苷酸的延伸

环十肽的实验条件同环九肽一致，利用上述合成的随机环十肽核苷酸模板（2.4.1中的链1）及引物（2.4.1中的F、R），进行PCR扩增，从而得到双链DNA。

按以下延伸体系：

PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离目的条带，琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化PCR产物。

1.3随机环十肽片段和pCantab 5E载体的酶切

将上述PCR纯化后产物及pCantab 5E载体进行Sfi I、Not I双酶切，酶切体系如下：

37℃过夜酶切，之后650 µL体系中加入13 µL的Sfi I酶，混匀后50℃，酶切5 h。

37℃过夜酶切，之后1000 µL体系中加入20 µL的Sfi I酶，混匀后50℃，酶切5 h。

酶切产物琼脂糖凝胶电泳分离目的条带，琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化酶切产物。

1.4随机环十肽片段与pCantab 5E载体酶切产物的纯化

做一块大孔的琼脂糖凝胶，称取0.6 g琼脂糖于锥形瓶中，加入50 mL TAE缓冲液，放于微波炉中加热至融化，倒入准备好的模具中，加入0.5 µL的染料，静置30 min。

将酶切产物加入到胶孔中，加入3 µL的2000 bp和3 µL的1 KB Marker，跑胶45 min。

电泳结束后，在紫外灯下快速切下含目的条带的凝胶于1.5 mL灭菌后的离心管中，用小刀碾碎，称取重量，100 mg凝胶等于100 µL体积。

向酶切片段的凝胶中加入3倍量的Buffer GDP，向载体的凝胶中加入等倍体积的Buffer GDP。55℃水浴加热至凝胶完全融化，期间可以颠倒几次加速融化。瞬时离心后向片段溶胶液中加入等倍凝胶重量的异丙醇，混匀。

瞬时离心，将FastPure DNA Mini Collumns-G吸附柱置于Colluection Tubes 2 mL收集管上。将溶胶液转移至吸附柱中，12000 rpm，离心1 min。

弃滤液，把吸附柱置于收集管中，加入300 µL的Buffer GDP至吸附柱中，静置1 min，之后12000 rpm离心1 min。

弃滤液，把吸附柱置于收集管中，加入700µLBµffer GW（已加入无水乙醇）至吸附柱中，12000 rpm，离心1 min。重复该步骤。

弃滤液，把吸附柱置回收集管中，12000 rpm，离心2min。

将吸附柱置于1.5 mL离心管中，加入30 µL灭菌水（55℃预热）至吸附柱中央，静置2 min，12000 rpm，离心1min。将回收产物放于4℃或长久保存于-20℃。

1.5随机环十肽片段与pCantab 5E载体的连接

将双酶切后的噬菌粒载体与双酶切后的环十肽DNA片段按物质的量比1:10的比例进行连接，连接体系如下：

16℃过夜连接，之后65℃，10 min，冰浴2min。

将500 µL连接产物转移至5 mL灭菌后的离心管中，加入3倍量的Buffer DC,然后均匀混合。将Spin Column安置于Collection Tube上，将上述溶液转移到Spin Column中，室温12000 rpm，离心1 min。弃滤液，将700 µL的Buffer WB（已加无水乙醇）加入到Spin Column中，室温12000 rpm，离心30s。重复该步骤。将Spin Column安置到Collection Tube上，12000 rpm，离心1 min。将Spin Column放置于1.5 mL灭菌后的离心管上，向膜中央加入30 µL灭菌水（55℃预热），静置2 min，12000 rpm，离心1 min。将纯化后的连接产物放于4℃或长久保存于-20℃。

1.6随机环十肽连接产物的电转化

将0.1 cm的电击杯置于冰上充分预冷，将TG1感受态细胞置于冰上融化，将复苏培养基提前放于37℃预热；（将所有连接产物分多次进行电转）；
TG1感受态细胞融化后，用手轻弹混匀，加入5 µL纯化后的连接产物，用手指轻弹混匀，放置于冰上静置10 min；
将上述混合液小心吸取到充分预冷的电击杯中，避免产生气泡。将电击杯放置于冰上，静置5 min。

调节电转参数：1.0 mm cuvette，10 µF 600 ohms，1800 Volts，设置好后进行一次空放电。将电击杯从冰中取出，仔细用吸水纸擦干，置于电击仓中进行电击。

取电击后的产物加入2 mL 37℃预热的复苏培养基置于50mL离心管中，37℃，200 rpm复苏1.5 h。

取1 µL进行梯度稀释。在LB-A平板上进行滴度测定，取各梯度10 µL滴到板子上，37℃过夜孵育。

计算平板上的菌落数，用于计算文库库容：库容=n×10（稀释倍数+2）。600µL文库菌液与400µL甘油混合均匀，即为噬菌体随机环十肽文库。

1.7噬菌体随机环十肽文库的鉴定

为测定噬菌体随机环十肽文库的容量，在建库的电转化过程结束后，取复苏后的少量菌液从101到104做10倍系列稀释，分别涂布于LB-A抗性平板上，过夜孵育后根据单菌落数以确定库容量。为鉴定随机环十肽库的多样性，从上述平板上随机挑取30个单菌落，接种到600 µL LB-A培养基中进行扩增摇菌，之后对其进行PCR扩增。将PCR产物进行DNA序列测定，并对构建的随机肽库的寡核苷酸的插入率、肽库的库容及多样性进行评价。

通过对构建的文库的库容、多样性、插入率等指标进行鉴定，满足筛选需求的条件，表明该文库构建成功。将构建好的三个文库，进行涂板并挑取单克隆菌株，环九肽、环十肽和多环肽文库各挑取30个单克隆菌株进行测序。对其进行文库鉴定，具体数据如下：

图1 环九肽文库测序序列图
Figure1 Sequencing results of random cyclic nonapeptide library

图2 环十肽文库测序序列图
Figure2 Sequencing results of random cyclic decapeptide library

所构建的环九肽、环十肽、多环肽各挑取30个单克隆菌株进行测序，其中环九肽中测序正确个数为25个，且正确的序列中多样性为100%；环十肽中测序正确个数为28个，且正确的序列中多样性为（27/28）×100%=96.4%。

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