1、TG1感受态细胞的制备

在超净工作台中，按1%的接种量取100 µL的TG1大肠杆菌菌液接种到10 mL的LB培养基中。

将培养基放于摇床中，37℃，220 rpm，培养1.5~2 h至OD600为0.4。

将菌液分装到50 mL离心管中，放置于冰上冰浴预冷10 min。

在超净工作台中，取1 mL大肠杆菌菌液于1.5 mL EP管中，4℃，4000 rpm离心10 min。

弃尽上清液，将菌体置于冰水浴中，用1 mL预冷的50 mmol/L CaCl2溶液轻轻混匀洗涤一次，冰水浴中放置30 min。之后，4℃，4000 rpm离心10 min。

弃尽上清液，将菌体沉淀用0.2 mL预冷的50 mmol/L CaCl2溶液重新轻轻悬浮。冰水浴中放置4 h后24小时之内使用。如果感受态细胞暂时不用，则可以用0.2 mL预冷的CaCl2-甘油混合液轻轻重悬上述菌体沉淀，分装成小份，迅速置-80℃冰箱冷冻保藏，可保存半年。

2、随机环九肽核苷酸的合成

图1 pCantab 5E质粒示意图
Figure1 Schematic diagram of pCantab 5E plasmid

编码随机环九肽核苷酸片段的设计策略是采用(NNK)9编码方式，其中编码随机环九肽核苷酸序列的前两个核苷酸为任意核苷酸N(A/T/C/G)，最后一个核苷酸根据密码子的简并性设计为K(G/T) 。根据载体上Sfi I、Not I酶切位点情况及构建噬菌体随机多肽文库的要求，设计了一条环九肽寡核苷酸片段链1及两条扩增引物正向引物F和反向引物R。链 1: 5'- GTTGTTCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTGTGCGGCCGCAGGTG
CGCCGGTGCCGTAT-3'，在 5'和 3'端 引入Sfi I、Not I酶切位点，用下划线表示; F: 5'- GTTGTTCCTTTCTATGCGGCCCAGC -3'，R：5'- ATACGGCACCGGCGCACCTG -3'。正向引物F和反向引物R能够分别与链1的5'和 3'端部分结合从而进行双链DNA的扩增。用灭菌去离子水将合成的DNA干粉溶解，得到浓度为10 µmol /L 的溶液，分装后于－20℃冻存。

3、构建噬菌体环九肽文库的条件优化

3.1 PCR反应中模板用量的确定

根据如下的PCR体系，在50 µL的PCR体系中分别加入101、103、105稀释后的1 µL核苷酸模板，进行PCR反应，反应完成后各取3 µL PCR产物进行凝胶电泳，观察胶图中，各模板浓度的PCR产物条带，以确定正式实验中核苷酸模板的用量。

3.2 酶切体系中限制酶用量及酶切时间的确定

根据如下的酶切体系，取1 µg的上述PCR产物及1 µg的pCantab 5E载体在37℃下进行酶切，PCR产物分别用1 µL、1.5 µL、2 µL的Not I酶进行酶切1 h、3 h、5 h和过夜酶切。pCantab 5E载体分别用0.5 µL、1 µL、1.5 µL的Not I酶进行酶切1 h、2 h、3 h、4 h、5 h和过夜酶切，酶切完成后加入等量的Sfi I酶,37℃反应5 h。以此来确定PCR产物及载体的最佳酶用量及酶切时间。

将酶切后的PCR片段及载体进行凝胶电泳，通过观察胶图上的目的条带的状态来确定最佳的限制酶用量及酶切时间。

3.3 连接体系中酶切片段与载体的连接比例的确定

将上述酶切片段和酶切载体分别按照3:1、5:1、10:1的连接比例进行连接，连接体系如下：

16℃过夜连接，之后65℃，10 min，放置于冰上2 min。

将连接好的重组质粒电转化到TG1大肠杆菌感受态细胞里，并进行复苏培养。将复苏后的含有重组质粒的TG1大肠杆菌菌液进行稀释后涂板于LB-A平板上，37℃过夜孵育。通过观察板上单菌落的数量（单菌落越多说明重组成功率越高）来确定最佳连接比例。

3.4随机环九肽寡核苷酸的延伸

利用上述合成的随机环九肽核苷酸模板（3.2中的链1）及引物（3.2中的F、R），进行PCR扩增，从而得到双链DNA。

按以下延伸体系：

PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离目的条带，琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化PCR产物。

3.5 随机环九肽片段和pCantab 5E载体的酶切

将上述PCR纯化后产物及pCantab 5E载体按照条件优化后的体系进行Sfi I、Not I双酶切，酶切体系如下：

37℃过夜酶切，之后650 µL体系中加入13 µL的Sfi I酶，混匀后50℃，酶切5 h。

37℃过夜酶切，之后1000 µL体系中加入20 µL的Sfi I酶，混匀后50℃，酶切5 h。酶切产物琼脂糖凝胶电泳分离目的条带，琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化酶切产物。

3.6随机环九肽片段与pCantab 5E载体酶切产物的纯化

做一块大孔的琼脂糖凝胶，称取0.6 g琼脂糖于锥形瓶中，加入50 mL TAE缓冲液，放于微波炉中加热至融化，倒入准备好的模具中，加入0.5 µL的染料，静置30 min。

将酶切产物加入到胶孔中，加入3 µL的2000 bp和3 µL的1 KB Marker，跑胶45 min。

电泳结束后，在紫外灯下快速切下含目的条带的凝胶于1.5 mL灭菌后的离心管中，用小刀碾碎，称取重量，100 mg凝胶等于100 µL体积。

向酶切片段的凝胶中加入3倍量的Buffer GDP，向载体的凝胶中加入等倍体积的Buffer GDP。55℃水浴加热至凝胶完全融化，期间可以颠倒几次加速融化。瞬时离心后向片段溶胶液中加入等倍凝胶重量的异丙醇，混匀。

瞬时离心，将FastPure DNA Mini Collumns-G吸附柱置于Colluection Tubes 2 mL收集管上。将溶胶液转移至吸附柱中，12000 rpm，离心1 min。

弃滤液，把吸附柱置于收集管中，加入300 µL的Buffer GDP至吸附柱中，静置1 min，之后12000 rpm离心1 min。

弃滤液，把吸附柱置于收集管中，加入700µLBµffer GW（已加入无水乙醇）至吸附柱中，12000 rpm，离心1 min。重复该步骤。

弃滤液，把吸附柱置回收集管中，12000 rpm，离心2min。

将吸附柱置于1.5 mL离心管中，加入30 µL灭菌水（55℃预热）至吸附柱中央，静置2 min，12000 rpm，离心1min。将回收产物放于4℃或长久保存于-20℃。

3.7随机环九肽片段与pCantab 5E载体的连接

将双酶切后的噬菌粒载体与双酶切后的环九肽DNA片段按物质的量比1:10的比例进行酶切片段和酶切载体的连接。

按下列连接体系：

16℃过夜连接，之后65℃，10 min，冰浴2 min。

将500 µL连接产物转移至5 mL灭菌后的离心管中，加入3倍量的Buffer DC,然后均匀混合。将Spin Column安置于Collection Tube上，将上述溶液转移到Spin Column中，室温12000 rpm，离心1 min。弃滤液，将700 µL的Buffer WB（已添加无水乙醇）加入到Spin Column中，室温12000 rpm，离心30 s。重复该步骤。将Spin Column安置到Collection Tube上，12000 rpm，离心1 min。将Spin Column放置于1.5 mL灭菌后的离心管上，向膜中央加入30 µL灭菌水（55℃预热），静置2 min，12000 rpm，离心1 min。将纯化后的连接产物放于4℃或长久保存于-20℃。

3.8 随机环九肽连接产物的电转化

将0.1 cm的电击杯置于冰上充分预冷，将TG1感受态细胞置于冰上融化，将复苏培养基提前放于37℃预热；（将所有连接产物分多次进行电转）；
TG1感受态细胞融化后，用手轻弹混匀，加入5 µL纯化后的连接产物，用手指轻弹混匀，放置于冰上静置10 min；
将上述混合液小心吸取到充分预冷的电击杯中，避免产生气泡。将电击杯放置于冰上，静置5 min。

调节电转参数：1.0 mm cuvette，10 µF 600 ohms，1800 Volts，设置好后进行一次空放电。将电击杯从冰中取出，仔细用吸水纸擦干，置于电击仓中进行电击。

取电击后的产物加入2 mL 37℃预热的复苏培养基置于50 mL离心管中，37℃，200 rpm复苏1.5 h。

取1 µL进行梯度稀释。在LB-A平板上进行滴度测定，取各梯度10 µL滴到板子上，37℃过夜孵育。

计算平板上的菌落数，用于计算文库库容：库容=n×10（稀释倍数+2）。600µL文库菌液与400µL甘油混合均匀，即为噬菌体随机环九肽文库。

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