单抗制备中杂交瘤细胞的筛选

在单克隆抗体制备过程中，有两次的筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择性培养基）;第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。

利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理：

① 一种淋巴细胞克隆只产生一种抗体；
② 细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性；
③ 利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞，并进行克隆化，然后大量培养增殖，制备所需的单克隆抗体。

第一次筛选的原理与方法：

　　细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的 HAT 选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其依据是细胞中的 DNA 合成有两条途径：

· 一条途径是生物合成途径（“D 途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为 DNA 分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而 HAT 培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断 DNA 合成的“D途径”。

· 另一条途径是应急途径或补救途径 （“S 途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。

　　因此，在 HAT 培养液中，未融合的效应 B 细胞和两个效应 B 细胞融合的“D 途径”被氨基蝶呤阻断，虽“S 途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般 10 d 左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟 嘌 呤磷 酸 核 苷转 移 酶 缺陷 型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S 途径”，且“D 途径”又被氨基蝶呤阻断，所以在 HAT 培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应 B 细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应 B 细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在 HAT 培养液中选择性存活下来，并不断增殖。

第二次筛选的原理和方法：

　　在单克隆抗体的生产过程中，由于效应 B 淋巴细胞的特异性是不同的，经 HAT 培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞群进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，继续进行有限稀释，一般重复 3～4 次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。第二次筛选也是鉴定的过程。

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