一、概述

蛋白A或蛋白G是细菌胞壁蛋白，它们能结合抗体Fc段。这一结合非常牢固，但其亲和力对pH的变化敏感，抗体/蛋白A或蛋白G的亲和力随pH值的降低而急剧降低。蛋白A或蛋白G亲和柱纯化抗体就是基于这种原理。

许多商家提供一系列共价偶联有蛋白 A和蛋白G的树脂。就大部分纯化操作而言，偶联的琼脂糖或聚丙烯酰胺微球是最佳选择。因为这些材料有良好的化学稳定性，能很好地承受色谱柱的物理压力，且价格相对低廉。操作时，先将蛋白A或蛋白G微球装柱，然后将粗制抗体在偏碱pH值情况下过柱。抗体在柱中和蛋白A或蛋白G结合,然后洗柱，用酸性缓冲液将抗体洗脱，再将洗脱液的pH调至中性，其中的抗体就可以备用。这种方法快速安全简单。

需要考虑的主要问题是对蛋白A或蛋白G的选择（见下表），它们对不同类型抗体的结合能力存在差异。通常建议用蛋白A纯化IgG_2a、IgG_2b和IgG₃等亚类鼠源单抗，而用蛋白G纯化IgG₁。对于其他种系来源的单抗，建议用蛋白G。对于多抗而言，兔、人、马、驴、猿、豚鼠、狗和牛等动物的样本应用蛋白A，而对于小鼠，大鼠以及山羊等动物的多抗，建议用蛋白G。

对蛋白A或蛋白G的选择
抗体来源	蛋白A	蛋白G
单抗
小鼠IgG1		√
小鼠IgG2a IgG2b，IgG3	√
大鼠		√
多抗
人	√
兔	√
小鼠		√
大鼠		√
马		√
山羊		√
驴		√
猪	√
地鼠	√
狗	√
牛		√

二、实验相关

1、所需试剂和特殊设备

1.0mol/L Tris（pH8.0）；100mmol/L Tris（pH8.0）；10mmol/L Tris（pH8.0）； 50mmol/L甘氨酸（pH3.0）；简单的柱状色谱仪。

2、操作步骤

（1）加入1/10体积的1.0mol/L Tris （pH8.0）， 调含抗体样品（血清，组织培养上 清液或腹水）的pH值至8.0。

（2）将抗体溶液通过蛋白A或蛋白G微球柱。这些柱中，每毫升的湿微球能结合大约10~20ml抗体（1个蛋白A或蛋白G微球分子结合2分子抗0体）。记录装柱微球的大约体积。因为微球柱的体积决定使用清洗和洗脱缓冲液的量。

（3）用10倍柱体积的100mmol/LTris （pH8.0）洗涤微球。

（4）用10倍柱体积的10mmol/LTris （pH8.0）洗涤微球。

（5）用50mmol/L甘氨酸（pH3.0）洗脱微球柱，每次加入约1/2柱体积的缓冲液，分次加入。用含1/10柱体积的1mol/LTris （pH8.0） 的试管收集洗脱液，将各管缓慢摇匀，使其pH值恢复至中性。

（6）测定各收集管的280nm光密度，以得到蛋白含量（1OD约相当于0.75mg/ ml免疫球蛋白）。或用布氏染色结合斑点实验测定蛋白含量。将含抗体的收集管混合，并取2μg,用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色测总蛋白。纯化的样品应有清晰的轻、重链带。

血清大约含10mg/ml 总IgG，组织培养上清液含20~ 50ug/ml单抗，而腹水含1~10mg/ ml。同所有蛋白溶液一样，应避免过度机械作用或接触空气，以便使蛋白变性降低到最低程度。

3、常见问题

用蛋白A或蛋白G柱常遇到的问题是个别来源的抗体不能很好的结合到树脂上。此种情况建议提高结合和洗涤使用的缓冲液盐浓度。蛋白A或蛋白G与抗体的Fc段的相互作用主要是通过疏水作用，加入高浓度盐有助于它们的相互作用而增加结合力，氯化钠浓度高达3. 3mol/L也起作用。

收集的抗体可能被低pH值的洗脱液破坏。不同种属或不同亚类的抗体应以不同pH值的酸性溶液洗脱。上述方法用pH值相同的洗脱液，除了少数情况外，还是可行的。然而，亦可使用pH值不太低的酸性洗脱液。可用同一试剂逐渐降低其pH值，以决定洗脱目的抗体所需的最温和条件。在分析研究中，用同一亲和柱纯化2种或2种以上抗体时应非常小心，因为不同的抗体与蛋白A或蛋白G的亲合力不同，这样很容易使某种抗体被亲和柱中残余的抗体污染。至于大样品纯化，建议对于相同来源的抗体使用固定的亲和柱。亲和柱应在4°C下存于硫柳汞中，需要时才取用。如果需要用同一亲和柱纯化多种来源的抗体，依次用2mol/L尿素、1mol/L 氯化锂和100mmol/L的甘氨酸（pH2.5）洗涤亲和柱，将能满足一般的纯化需要。

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