单克隆抗体制备服务案例

　　本案例基于使用蛋白抗原免疫小鼠产生应答，融合产生杂交瘤细胞筛选阳性单克隆细胞株的方法制备单抗，经检测获得的抗体效价可达1:10万以上，获得可配对的4株抗体。本案例所涉及数据及实验方法结论，未经钟鼎生物授权，任何单位及个人不得转载或盗用，违者必究！

一、实验设计

　　利用钟鼎表达的重组蛋白SVC做为抗原，免疫BALB/c小鼠，3免后检测效价，达标后取脾脏细胞融合骨髓瘤细胞获得杂交瘤细胞，通过有限稀释法筛选单克隆抗体细胞株，定株后的细胞株所得的腹水进行protein A纯化获得单克隆抗体并进行抗体标记，通过夹心ELISA方法进行检测XXX蛋白。根据检测结果其中4E5.12F5.4C12.4F12纯化的单克隆抗体可互相配对，并进行胶体金标记及试纸条制备。

二、试剂和耗材

名称	公司	名称	公司
DMEM高糖、DMEM低糖、高糖DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、opti SFM、转染试剂等	Invitrogen（Gibco）	无内毒素质粒中提试剂盒、LAL内毒素检测试剂、基础化学试剂、PEG等	Sigma公司
六孔板、细胞培养瓶、离心管	corning公司	细胞计数板	Improved Neubauer
液体石蜡	钟鼎生物公司	96细胞培养板	Costar
其他常规生化试剂均为国产分析纯

三、主要实验仪器

仪器名称	公司	仪器名称	公司	仪器名称	公司
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机	美国BECKMAN公司	台式高速离心机	德国SORVAL公司	Biologic LP层析系统、Mini Protean II垂直平板电泳系统、Gel Doc2000成像系统、水平电泳系统	美国BIO-RAD公司
PTC-200基因扩增仪	美国MJ Research公司	320-S pH计	美国Mettler Toledo公司	AR5120电子天平	美国AHOM S公司
MultiTemp III 恒温水浴锅、Hofer ΜV-25紫外透射仪	美国Amersham Pharmacia公司	雪花状制冰机	日本SANYO公司	JY92-2D超声波细胞粉碎机	中国新芝科器研究所
蛋白核酸检测仪	南京大学普阳科学仪器厂	NANODROP2000	美国Thermo公司	超净工作台	中国苏净集团

四、实验分析及设计

1. 动物免疫

　　选取6只6-8周龄雌性BALB/c小鼠，将XXX蛋白与弗氏完全佐剂混合首次免疫，皮下注射100ug，2-3周加强免疫一次，采用弗氏不完全佐剂与抗原混合，皮下注射100ug。四免后采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对XXX蛋白的效价，待效价大于1:10,000，选择1-2只小鼠进行细胞融合安排。

2.细胞融合

2.1 骨髓瘤细胞制备

　　融合前一周，用含10%FBS DMEM培养基扩大培养SP2/0细胞。到融合时，细胞长满大约6瓶T25细胞培养瓶，在融合当天收集SP2/0细胞到50ml离心管中，1000rpm,5min离心。弃上清，然后再加入20ml DMEM基础培养基，吹散细胞然后计数。

2.2 脾细胞制备

　　四次免疫后血清ELISA效价在1：10000以上的小鼠，在融合前3天终免，腹腔注射抗原100ug。融合当天用颈椎脱臼法安乐死要融合的小鼠。用75%酒精浸泡5min.无菌取脾脏，把脾脏放入内有10mlDMEM基础培养的培养皿中。取筛网放入另一个平皿中，将脾脏转移到筛网上，用注射器内心研磨脾脏。加入DMEM到筛网上，冲洗筛网，使脾细胞更多的收集到平皿中。将细胞移至10ml离心管中，用不含血清的DMEM洗脾细胞两次， 1000 rpm离心5min，收集脾细胞计数。

2.3细胞融合

　　混合骨髓瘤细胞和脾细胞，使骨髓瘤细胞同脾细胞数量比在1：20为宜。把细胞放到50ml离心管中，用DMEM基础培养基稀释，然后离心1000rpm 5min。弃上清。摇动离心管使细胞均匀。缓慢加入0.8ml 50%PEG，反应90秒，然后加入20-30ml DMEM培养基终止PEG，把融合的细胞放到37℃水浴锅中反应10分钟。 1000rpm 5min，弃上清然后加入HAT DMEM培养基. 把融合的细胞铺到96孔板中，每孔100μl。然后将细胞培养板放到CO2培养箱中培养。融合后4天查看，杂交瘤细胞克隆率在50%以上，有少量的细胞碎片，细胞生长状态良好。融合10天后开始进行筛选检测。

3. 融合筛选及亚克隆

3.1 融合筛选

　　在检测的前一天，用PBS包被5ug/ml抗原于ELISA板，过夜。次日吸取细胞上清100ul/孔进行ELISA检测根据ELISA结果，判断阳性孔（样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1则判定为阳性孔。用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次确认检测，进一步确认阳性孔。确定后的阳性孔细胞进行亚克隆。

3.2 亚克隆

　　吹打阳性孔中细胞，计数，在离心管中加入N/4 ml DMEM培养基，取100ul细胞悬液到离心管中，吹匀后留1ml，补加DMEM到4ml，吹匀，留100ul（约2滴）在管底。在离心管中加DMEM至5ml，混匀后滴加至96孔板的前三行，每孔一滴管底留1.8-2ml左右，补加DMEM至5ml，吹匀后滴加至96孔板的D、E、F三行，每孔一滴，管底留1.5-1.8ml左右，补加DMEM至2.8-3ml左右，吹匀后滴加至96孔板的G、H行，每孔一滴，7-10天后在显微镜下观察，检测有克隆生长的孔，标记出单克隆的孔，尽可能挑取阳性的单克隆细胞进行再次亚克隆，检测至100％阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株。

4. 腹水制备及纯化

4.1腹水制备

　　每只小鼠腹腔内注射0.5ml液体石蜡，7天后30天以内向预处理过的小鼠腹腔内注射杂交瘤细胞。按每只小鼠注射1x106个细胞的量，注射杂交瘤细胞。7至十天，用注射器针头小心采出尽可能多的液体。小鼠在最后一次采集后颈椎脱位法处死。

4.2 腹水纯化

　　将所收集的腹水离心取上清，准备好蛋白A琼脂糖介质并装柱，将腹水用PBS稀释10倍后缓慢上样，上样结束后用磷酸盐缓冲液洗涤至紫外检测仪达到最低值，甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4度透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定。

五、实验结果

5.1 4免后小鼠血清效价 ELISA 结果

经免疫后小鼠均产生高效价抗血清，具体结果如下：
包被抗原： 蛋白XXX
包被浓度： 5 ug/ml, 100ul / 孔
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.4)
二抗： 兔抗鼠-HRP

表 1: 血清Elisa 结果（起始稀释度: 1:500，效价即样品OD/空白OD＞=2.1的最高稀释度）

5.2 融合筛选结果

选取效价较高的3#小鼠进行细胞融合，经ELISA筛选阳性克隆结果如下：
包被抗原： 蛋白 XXX
包被浓度： 5 ug/ml, 100ul / 孔
包被缓冲液： 磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.4)
二抗： 兔抗鼠-HRP

表 2： 融合后细胞上清ELISA 结果

5.3 亚克隆细胞定株后结果