1、抗体覆盖率是什么？高抗体覆盖率的优势？

答：抗体覆盖率是指ELISA试剂盒中所使用抗体能识别待检样品中的HCP与总HCP种类比例。检测HCP应用最广泛的方法就是ELISA方法，它检测的是总HCP含量。但是HCP组成不一，每一种蛋白含量也不一致，作为免疫原产生抗体的能力也不相同，所以由此制备的抗HCP抗体并不能完全检测HCP中所有成分，可能存在“漏检”的情况，所以需要评估HCP ELISA抗体的覆盖率。HCP抗体的覆盖率越高，能识别出的HCP种类越多，对HCP的定量越准确。

2、抗体覆盖率用什么方法？怎么保证覆盖率检测的重复性？

答：美国药典UPS 1132中建议使用2D-SDS-PAGE/Western或DIGE方案对ELISA检测试剂盒中HCP抗体进行覆盖率验证。Cygnus首推了采用AAE-2D方式进行覆盖率验证。由于2D技术本身的限制：包括检测上样水平、样本状态、染色条件和抗体检测条件等，都容易造成验证报告水平的波动。且AAE-MS的方式，在报告水平上更具重复性。虽然MS方法还未正式纳入药典建议方法，但是USP新增章节已经写入了关于采用质谱方法进行HCP分析的意见稿。

3、目前对抗体覆盖率的要求，覆盖率达到多少可以用于ELISA？

答： 同一抗体利用不同方法来检测抗体覆盖率最后得到结果可能不同，目前国内国外对HCP覆盖率没有明确规定需要达到多少，如果在IND时使用的是商业化试剂盒，则需要对覆盖率进行验证，如果用2D-WB检测抗体覆盖率最低要求要大于50%，大于75%一般足够能满足监管要求。

4、用ELISA检测HCP时，怎么保证标准HCP的一致性？怎么保证HCP标准品与产品生产时出现的HCP的一致性？

答： 关于试剂盒标准物质的一致性，一般建议一次性生产制备足够多HCP原材料，避免多批次工艺导致的HCP种类差异，其次HCP标准品应进行表征和稳定性监测，避免发生降解，最后不同批次的HCP标准品制备要有企业质控品进行质量检测。而试剂盒的标准物质于产品中的HCP一般有较大差异，因此USP建议对临床后期的产品，采用平台型或工艺特异性试剂盒进行HCP残留报告，其目的是开发与产品HCP组成相似的标准物质以及相对应抗体，用于真实地反映产品中HCP的残留水平。

5、商品化试剂盒和专属性试剂盒的区别在哪里？什么时候需要用到专属性试剂盒？

商品化HCP ELISA KIT是市售的通用试剂盒，专属性HCP ELISA KIT是为某一种药物特定的工艺开发的ELISA方法。由于生产工艺的特殊性，药物成品中所含有的HCP从组成以及相对含量来看与通用试剂盒的标准HCP物质组分都有显著差异，使用通用试剂盒无法准确为特殊工艺生产成品中的HCP定量。且专属试剂盒所用的抗体也能更好地识别或反映出成品HCP的真实水平，因此针对特定产品的HCP残留定量报告，USP建议采用专属试剂盒或平台型试剂盒用于产品从临床III期到产品上市后的全生命周期质量放行。目前国内制药公司通常在临床二期之前都是选择商品化HCP检测试剂盒，到了临床三期及以后再选择平台工艺HCP方法或上游工艺专属HCP方法。如果希望将商品化试剂盒应用于临床三期和上市后，则应充分证明试剂盒中主要试剂（如标准品、抗体等）适用于本工艺的HCP检测。

6、如果确实存在基质干扰该怎么解决，只能换样品里的缓冲液吗？

如果存在样本基质干扰，建议首先尝试将样本进行适当稀释，寻找到一个最小稀释倍数（MRD），此时样本基质对检测无干扰，并且样本的加标回收率符合要求（70-130%），再往下稀释，各个稀释点间的报告值应呈现线性相关，其回算值应符合准确度范围。如果遇到特殊样本，稀释无法解决问题，则可以考虑合理地前处理方法，包括缓冲液置换等。但是需要非常谨慎地采取前处理，降低处理过程可能对HCP造成的损失。

7、对于不同稀释倍数检测到的结果，以哪个倍数的结果为准呢？

对于一个可靠的检测结果（无基质干扰），其不同稀释倍数的检测数值乘上稀释倍数最终得到的结果偏差应在20%以内，在符合偏差的情况下，建议取最高值进行残留报告。

8、抗原制备的时候是经过纯化，是收集最终产物还是上游工艺也会收集后进行混合作为免疫抗原？

根据不同工艺而定，一般通用试剂盒会选择上游工艺的发酵液（或细胞裂解液），项目专属性试剂盒会根据实际工艺中产品性质选择特定工艺节点的产物进行抗原制备。

9、专属试剂盒的定制一般是一次性，后续如果还需要制备，换批时应该做哪些工作呢？

一般专属性试剂盒定制会一次制备足够多的抗原和抗体（满足项目结束），如果发生特殊情况，需要再制备则需要重新进行抗原表征和抗体覆盖率验证。

10、试剂盒对酸碱的耐受度如何？

由于ELISA采用抗原抗体结合的检测原理，因此过酸过碱都会影响报告结果，建议检测前对样本pH值进行检查，如果pH值在6.5-8.0之外，建议报告前进行适当中和；如果经过适当稀释，可以满足样品准确度要求，也可通过样本稀释方式降低样本pH对检查的干扰。

11、通过添加标准品排除基质干扰时，加标回收率在70-130%合适还是80-120%合适呢？

根据USP药典法规要求，HCP的检测回收率要求在 70-130% （在定量限附近的回收率可接受范围 50-150%）。

12、使用商品化试剂盒，企业方法学还需要全面验证吗？

对于商业化试剂盒企业一般需要验证试剂盒的系统适用性和对自己样本的适用性。

13、如果样本基质有干扰，但检测值本身就低，通过稀释降低干扰就可能导致检测值低于定量限，结果怎么报告，或者该试剂盒不适用？

建议优先通过不同试剂盒或经验证的前处理对样本残留在LLOQ以上进行准确报告，其次可以考虑，在最小稀释倍数（MRD）条件下，将检测结果报告为：＜定量下限*（MRD）稀释倍数。

14、免疫的抗原，与试剂盒中的标准品处理方式一样吗？细胞制备的蛋白作为免疫的抗原是否可以含有蛋白酶抑制剂？作为标准品可以加蛋白酶抑制剂吗？细胞蛋白制备是物理方式好还是可以使用商品化细胞裂解液好？

（1）HCP抗原的处理可能与标准品处理方式相同也可能不同，要根据抗体制备工艺确定抗原制备及处理方案，一般作为抗原不添加蛋白酶抑制剂，原因有两方面，一是蛋白酶抑制剂对于免疫动物是有害的，二是有些蛋白酶抑制剂是多肽，可能在动物体内产生抗体。
（2）做为标准物质，可以加入蛋白酶抑制剂，前提是不干扰检测，并且满足量值溯源工艺要求。
（3）宿主蛋白的制备工艺，无论是采用物理方法（如高压破碎），还是酶、表面活性剂或商品化裂解液等，优先需要考虑的是与实际工艺一致；其次考虑工艺对HCP收获的影响；再次考虑工艺的可重复性。具体如何选择，可以结合以上影响因素进行综合考虑。

15、当检测结果低于定量限时，结果报告形式：＜方法定量限*稀释倍数，这种情况下为什么还要稀释？是因为基质的影响吗？

任何一个报告值都必须建立在准确度合格的前提下，如果样本稀释线性、加标回收率不合格，那么可能存在样本基质干扰，因此所谓低于LLOQ的报告就不够准确，无法简单地据此进行残留水平报告。

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