使用说明书

　　声明：尊敬的客户，感谢您选用本公司的产品。本产品适用于定量检测待测样本中天然或重组E2蛋白浓度。

　　使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分!如有疑问，请及时联系钟鼎生物技术有限公司。

中文名称	规格	保存条件
ELISA 酶标板（可拆卸）	8×12	4℃
标准品(冻干粉)	2支	4℃
HRP酶结合物	2 瓶 10mL/瓶	4℃
浓缩洗涤液（20×）	1 瓶 20mL	室温
样品稀释液	1 瓶 20mL	4℃
底物溶液（TMB）	1瓶 10mL	4℃(避光)
反应终止液	1瓶 10mL	4℃

特别说明：

     相关试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些，请在使用时量取而非直接倒出！

检测原理

     本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗E2蛋白抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的E2蛋白会与包被抗体结合，HRP标记抗体也可特异性的与E2蛋白结合，形成包被抗体-E2蛋白-HRP标记抗体免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，E2蛋白浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中E2蛋白的浓度。

样品处理

     检测样本应平衡至室温（16℃-25℃），冷冻保存的样本切忌反复冻融
     样品中检测物浓度高于标准品最高值时，请根据实际情况，做适当倍数稀释（建议先做预实验，以确定稀释倍数）。

试验所需自备物品

     1.酶标仪(450nm波长滤光片)
     2.高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
     3.37℃恒温箱，双蒸水或去离子水
     4.吸水纸
     5.保鲜膜

     样品中检测物浓度高于标准品最高值时，请根据实际情况，做适当倍数稀释（建议先做预实验，以确定稀释倍数）。

检测前准备工作

     1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

     2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:19)。未用完的放回4℃。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃，使用时洗涤液应为室温）。当日使用。

     标准品:加入纯水1.0mL至冻干标准品中，旋紧管盖，上下颠倒数次，待其充分溶解后，轻轻混匀（浓度250ng/mL）。然后根据需要进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。建议配制成以下浓度250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0.24、0ng/mL，样品稀释液直接作为空白孔0ng/mL。

洗涤方法

     1.自动洗板机：每孔加入洗涤液350μL，注入与吸出间隔60秒。

     2.手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350μL，吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。

     标准品:加入纯水1.0mL至冻干标准品中，旋紧管盖，上下颠倒数次，待其充分溶解后，轻轻混匀（浓度250ng/mL）。然后根据需要进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。建议配制成以下浓度250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0.24、0ng/mL，样品稀释液直接作为空白孔0ng/mL。

操作步骤

     实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。

     1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μL，余孔分别加标准品或待测样品100μL，加上覆膜， 37℃孵育1小时。
2.弃去孔内液体，甩干，洗板3次，大约350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
3.然后每孔加HRP酶结合物100μL，加上覆膜（可用保鲜膜）， 37℃孵育1小时。
4.弃去孔内液体，甩干，洗板4次，大约350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
5. 每孔加底物溶液(TMB)100μL，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右（根据实际显色情况酌情缩短，但不可超过15分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止）。每孔加终止液100μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。
6. 立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（OD值）。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
7. 实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存。

结果判断

     1. 每个标准品的OD值减去空白孔的OD值后作图，如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。亦可以OD值为横坐标，标准品的浓度为纵坐标，绘出标准曲线。

     2. 推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或1.4，在软件界面既可根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；亦可将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

     3. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

灵敏度、检测范围、特异性和重复性

*  灵敏度：最小可测3.91ng/mL。
*  检测范围：0–250ng/mL。
*  特异性：可检测重组或天然的E2蛋白，且与其它相关蛋白无交叉反应。
*  重复性：板内，板间变异系数均大于15%。