多肽的制备与纯化

由于多种原因，经常要将蛋白质转变为多肽用于测序。比如需要关于制备基因克隆DNA探针的序列信息时，含有甲硫氨酸或色氨酸的多肽可能就非常有用，因为这些氨基酸只由一个三联体碱基密码所编码。含色氨酸的多肽可在 280nm吸光度下检测。理想情况下，色谱洗脱液可用双通道检测器 （设定为 220nm和280nm）或二极管检测器 （测定各峰的吸收光谱）检测。含甲硫氨酸的多肽可用氨基酸分析或特定标记测定。30个氨基酸残基以内的多肽需要用 FAB质谱以得到较好的测序结果。制备和纯化这类多肽的常用方法如下文所述， 也可参见有关文献。

对于制备分子量较小的多肽有许多方法，首先要使蛋白还原并且不可逆修饰所有的半胱氨酸残基。这样可防止二硫键的形成或交换，有利于随后测序中半胱氨酸的确定 （未修饰的半胱氨酸会转变为难以检测的产物）。通常使用的试剂包括碘乙酸和2-乙烯吡啶。还原和巯基修饰的方法：将蛋白质溶解于不超过1ml 的6mol /L氯化胍或含8mol /L去离子尿素的0.5mol /L的 Tris-HCl，pH＝8.0～ 8.5，1mmol/L EDTA的溶液中，也可加入不超过1%的SDS以保证蛋白质的溶 解。加入10μl的2-巯基乙醇或DTT，浓度达到10mmol /L，N₂环境暗室20～ 35℃保温1～3h。加入无色碘乙酸或碘乙酰胺 （250mg/ml溶于0.1mol /L NaOH 溶液，体积不超过0.1ml）或4-乙烯吡啶 （25mmol /L乙腈溶液），N₂环境暗室室温分别保持20min。丙酮沉淀，透析，凝胶过滤回收蛋白。

用于制备小分子多肽最常用的方法是：

①在甲硫氨酸残基后溴化氰化学裂解；

②在赖氨酸或精氨酸残基后利用胰蛋白酶，或谷氨酸残基后利用Staphylo-coccus aureus V8内切蛋白酶 Glu-C酶法降解。还有一些其他的化学方法和酶法降解。

利用各种酶，如内切蛋白酶 Arg-C、Asp-N、Glu-C以及Lys-C进行有限的蛋白质降解，可以得到N末端阻断的蛋白质序列数据 （如下表）。含有最多1% SDS的电洗脱蛋白液可以进行蛋白质降解，该方法可与SDS-PAGE联用。降解后得到的多肽通过SDS-PAGE分离回收。

试剂	条件
内切蛋白酶 Arg-C	100mmol/L NH4HCO3 溶液，20～37℃保持8h。冷冻，煮沸或加入10mmol/L的 PMSF终止降解反应
内切蛋白酶 Asp-N	50mmol/L 磷酸钠，pH8.0溶液，20～37℃保持18h。可含有最多1mol/L尿素，1mol/L氯化胍或0.01%SDS
内切蛋白酶 Glu-C	同 Arg-C，最多可含有0.5% SDS
内切蛋白酶Lys-C	同 Arg-C，最多可含有0.1% SDS
胰蛋白酶	同 Arg-C
溴化氰(CNBr)	70% HCOOH溶液，最多可比Met过量1000倍，N2环境室温暗室保持24h。旋转蒸发终止反应（注意：CNBr可形成有毒物质）

多肽混合物可借助反相或离子交换 HPLC或FPLC得到充分纯化。由于混合物一般比较复杂，通常需要利用几种色谱方法。首先可利用的是离子交换色谱，然后是反相色谱。此外，也可尝试在两个不同pH条件下的反相色谱。最终的色谱分离 （反相体系）最好是在可挥发的缓冲液中进行，如0.1%的三氟醋酸 和乙腈溶液。这样多肽样品就可以利用离心浓缩器进行充分的真空干燥。以少量体积溶液溶解多肽，一般1%的三氟醋酸-乙腈 （50:50，体积比）溶液对大多数多肽都较适合，样品可转移到气相测序仪进行测序。对于固相测序，含有SDS 的缓冲液可适用于联用方法。

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