本产品是用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇定量分析的酶联免疫试剂盒。试剂盒包含 96 孔和 48 孔测试所需的试剂，包括标准品。
需要实验室配备酶标仪。

检测范围:谷物、饲料、DDGS、麦麸和次粉。

样品前处理
   - 谷物 (玉米，小麦)、饲料、DDGS：研磨，甲醇水提取， 过滤，稀释 (可选)。
   - 硬质小麦：研磨，水提取，离心，稀释。
   - 麦麸和次粉：水提取，活性炭净化，过滤，稀释。

检测时间: 20 分钟 (不包括样品前处理时间)。

检出限
   玉米，小麦，饲料，DDGS：0.04 ppm。
   硬质小麦：0.12 ppm。
   麦麸和次粉：0.24 ppm

特异性
化合物	交叉反应率 %
3-乙酰基-DON DON 3-葡萄糖基-DON 15-乙酰基-DON 雪腐镰刀菌烯醇	＞100 100 64±16 2 ＜4

1.检测原理   该测试是在包被有特异性抗 DON 抗体的微孔板中进行. 在预混合孔中，将酶标记的 DON 和标准溶液或样品 混合，然后转移到包被有抗 DON 抗体的微孔板中。
在第一次孵育期间，标准溶液/样品中的游离脱氧雪腐镰刀菌烯醇和酶标记的脱氧雪腐镰刀菌烯醇竞争固相上的抗 DON 抗体结合位点，然后在洗涤步骤中除去任何未结合的酶耦合物和 DON 分子。加入固定量的生色底物将无色色原体转化为蓝色产物。添加终止试剂会导致颜色从蓝色变为黄色，用酶标仪在 450nm 处测量吸光度。溶液颜色的深浅与标准溶液/样品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓度成反比。

2.提供的试剂

提供的试剂
微孔板：包被抗 DON 抗体,装于带有干燥剂的铝箔袋中。	预混合孔板： 未经包被的空白孔。 微孔板可独立拆分，单独使用。
DON 标准品：5 瓶，浓度分别为：0 ppm；0.04ppm；0.25 ppm；1.25 ppm；5 ppm	酶耦合物：1 瓶。
洗涤缓冲液 10X：1瓶, 50 ml。	发展液：1 瓶。
终止液：白色盖子。

3.未提供的试剂及耗材

未提供的试剂及设备
霉菌毒素提取液 A 或 70% 甲醇 (小麦,玉米,饲料)； 100% 甲醇 (硬质小麦, 麦麸和次粉)	离心机 (硬质小麦) 或滤纸 (Whatman 1) (小麦,硬质小 麦,玉米,饲料)；玻璃纤维过滤器 (Whatman 934AH) (麦麸和次粉)
蒸馏水或去离子水	天平
NaCl (小麦,玉米, 饲料)	粉碎机或研磨器
振荡器（可选）	活性炭 (Sigma C3345)
吸水纸	20~200 ul 可调微量移液器
酶标仪（450nm）	50~300 ul 多通道可调微量移液器 (可选)

4.使用者注意事项

- 仅供体外诊断使用。
- 部分试剂含有防腐剂，终止液含有硫酸并且有刺激性；标准品中包含甲醇而易燃。小心处理试剂，避免接触皮肤、眼睛和黏。。

5.处理和存储说明

- 在2 ~ 8℃保存，不能冷冻。
- 将未使用的微孔板放回到装有干燥剂的铝箔袋中。
- 不要使用过期的产品。
- 不要混合不同批次的试剂。
- 请使用使用试剂盒内附带的说明书。

6.样品处理

⑴小麦, 玉米和饲料

- 充分混匀待测样品。
- 细细粉碎样品。
- 称取粉碎后的样品，选择下表中描述的任一选项。

样品量	NaCl	提取溶液
50 g	10 g	250 ml 70% 甲醇
5 g	1 g	25 ml 70% 甲醇
50 g	/	250 ml 70% 甲醇, 4% NaCl
5 g	/	25ml 70% 甲醇, 4% NaCl

(2)硬质小麦

①充分混匀待测样品
②细细粉碎样品。
③称取 50 g 粉碎后的样品添加 250 ml 蒸馏水。另外： 称取 5g 粉碎后样品，加入 25ml 蒸馏水。
④充分振荡 15 分钟。注意：建议手动或通过温和的提 取系统进行摇动；使用磁力搅拌器、涡旋混合器会使 检测结果偏高。
⑤过滤样品并收集滤液。注意：过滤过程比较缓慢， 建议过滤前让样品先沉淀下来，作为替代方案，我 们建议以 3500g 离心样品 5 分钟并回收上清液。
⑥用 100％甲醇 1:3 稀释滤液（例如 100μl 滤液+200μl 100％甲醇）。样品的检测范围为 0.12-15 ppm。 如果样品浓度 ＞15 ppm ，将滤液在 70％甲醇中稀释 5 倍（1 份滤液 + 4 份 70%甲醇溶液），以获得测量范 围 0.6 -75 ppm。

为了使样品更具有代表性，建议选择称取 50g 样品的方式。

(3)DDGS

①充分混匀待测样品。
②细细粉碎样品。
③称取 50 g 粉碎后的样品并添加 250 ml 70%甲醇溶液。 另外：称取 5 g 粉碎后的样品并添加 25 ml 70% 甲醇 溶液。
④彻底摇晃或振荡 15 分钟。
⑤过滤样品 (Whatman 1) 并收集滤液。样品的测量范围 为 0.04-5 ppm。
⑥如果样品浓度 ＞5 ppm，将滤液在 70％甲醇中稀释 5 倍（1 份滤液 + 4 份 70%甲醇溶液），以获得测量范 围 0.2-25 ppm。

为了使样品更具有代表性，建议选择称取 50g 样品的方式。

(4)麦麸和次粉

①充分混匀待测样品。
②称取 10 g 样品并添加 100 ml 蒸馏水。
③充分振荡 3 分钟。注意：建议手动或通过温和的提取 系统进行摇动；使用磁力搅拌器、涡旋混合器会使检 测结果偏高。
④静置样品。
⑤在含有活性炭(Sigma C3345)的小瓶中转移上清液， 1ml 样品提取液使用 2mg 活性炭，例如：称取 10 mg 活性炭添加 5 ml 样品提取液。
⑥彻底振荡 30 秒。
⑦在玻璃纤维过滤器上立即过滤样品(Whatman 934AH)， 并收集滤液。
⑧用 100%甲醇 1:3 稀释滤液（1 份滤液+2 份 100%甲 醇），使样品的测量范围达到 0.24-30 ppm 。

7.实验前的准备工作

①DON 标准品：即时使用。
②酶耦合物：即时使用。
③洗涤缓冲液：使用前用蒸馏水 1:10 稀释（1 份洗涤缓冲液+9 份蒸馏水）；注意：在晶体存在的情况下，将溶液在室温下搅拌并完全溶解。
④稀释的洗涤缓冲液在室温下保存 24 小时，在 2-8℃下保存两周。
⑤发展液：即时使用；溶液对光敏感，需避光保存。
⑥终止液：即时使用。注意：该溶液包含 1 M 硫酸，小心轻放，如遇接触，请用自来水彻底冲洗。

8.分析步骤

8.1.初步准备

(1).预先安排好实验流程，记录好每个标准品/样品的位置，如果条件允许，建议做平行实验。把未使用的微孔条放回原来有干燥剂的铝箔袋 中，并用夹子夹好同时也准备好同样数量无包被抗体的空白预混合孔. 注意：建议在每次测定中不超过48孔包括标准品）；如果不使用多道移液器，则建议在每次测定不超过16孔（包括标准品）
(2). 添加 100ul 酶耦合物到每个预混合孔中；
(3). 添加 50ul 标准品/样品到相应的预混合孔中；
(4). 使用微量移液枪，混合每个预混合孔的内容物 （移液器上下三次），立即将100ul转移到相 应的抗T2毒素抗体包被的微孔中；
(5). 室温孵育10分钟；
(6). 不要延长第一步的孵育时间，在孵育过程中不要摇 动微孔板；
(7). 洗板
①- 孵育结束后倒掉孔中的液体.
② - 用稀释后的洗涤缓冲液填满微孔，倒掉微孔中的液 体.重复清洗步骤三次.
③ - 将微孔板倒扣在吸水纸上轻轻敲打，清除残留的液 滴.
不要让微孔变干.
(8). 添加100ul发展液到每个微孔中，并彻底混合几秒钟.
(9). 室温下避光孵育 10 分钟.
(10).添加50ul 终止液到每个微孔中，并彻底混合几秒钟.
(11).在450nm 处测定吸光度值.在15分钟内读数.

9.结果计算

   将每个标准品和样品的吸光度值除以标准0（B0）的吸光度并乘以100；因此，最大结合（B0）等于100％，吸光度值以百分比表示

根据每个样品的B/B0值和DON 标准品浓度绘制标准曲线.

将每个样品的B/B0值插入校准曲线中得到相应浓度,标准品浓度（ppb）已经考虑了样品稀释因子：
- 小麦,玉米,DDGS 和饲料：在标准曲线上读取的值对应于样品中的 DON，因为标准浓度已经考虑了样品稀释因子；
- 硬质小麦：将校准曲线上读取的值乘以稀释因子3；
- 麦麸和次粉：将校准曲线上读取的值乘以稀释因子 6；
- 所有样品：如果提取物被进一步稀释 5 倍以获得更大的剂量范围，则将结果乘以因子 5。

10.标准曲线示例

11.结果评估

在结果出具之后，有必要验证测定性能。通过将获得的数据与试剂盒中给出的数据进行比较来执行验证。如果值超出给定的数据，建议检查试剂盒的失效日期，吸光度记录的波长以及所用的程序。如果没有出现操作错误，请联系我们的技术支持。

12.试剂盒参数

㈠分析参数

Bo 吸光度	≥ 0.7 OD450nm
B/Bo 50%	0.06 – 0.5 ppb

㈡分析性能

LOQ	小麦, 玉米, 饲料： 0.125 ppm
	硬质小麦： 0.25 ppm

13责任

使用试剂盒评估为阳性的样品必须用确认方法重新测试。对由于不正确使用该试剂盒而导致的任何客户损失以及因结果而采取的任何行动不承担任何责任.

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