DAP-seq超详细实验流程

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DAP-seq超详细实验流程

DNA亲和纯化测序(DAP -seq),作为新一代转录因子(TF)结合位点(TFBS)发现试验,相比ChIP-seq具有快速、廉价、高通量等优势。接下来本文就将分享DAP-seq的详细实验操作流程,仅供参考。

1.DNA文库制备

(1)片段化,将5μg的基因组DNA用EB缓冲液稀释至125μl。

(2)将稀释后的样品转移至Covaris微管内,使用Covaris S2超声仪的‘200-bp target peak size’方案进行超声。

(3)样品清理,将超声过的样品转移至干净的1.5ml的离心管内,加入12.5 μl 的3 M NaOAc (0.1× volume)和250 μl 的 冷 100% (vol/vol) 乙醇(2× volume),涡旋混合样品。

(4)冰上或者−20°C孵育至少15分钟,但是最长不超过24小时。

(5)离心机最高转速(20,000g)在4°C将样品离心20分钟,倒出上清。

(6)离心沉淀用70% (vol/vol)乙醇洗涤,离心机最高转速在4°C将样品离心10分钟,倒出上清。

(7)室温下以3,000g的条件快速离心5秒,吸走乙醇,注意不能吹散DNA沉淀。

(8)干燥DNA沉淀,可以室温10–15分钟,也可以37°C 5–10分钟,保证重悬前DNA完全干燥,如果干燥时间过长会导致难以重选,但是这不会损伤DNA。

(9)用34 μl的EB缓冲液重悬DNA,置于37°C温育5分钟以加速DNA溶解。

(10)末端修复,向上一步产物中加入末端修复试剂盒内的如下试剂进行末端修复反应。

Component Amount per reaction (μl) Final amount/concentration
10× End-It buffer 5
10 mM dNTP mix 5 1 mM
10 mM ATP 5 1 mM
End-It enzyme mix 1

(11)轻柔混合并在室温下以3,000g的条件快速离心5秒,室温孵育45分钟。

(12)样品清理,向样品中加入5 μl 的3 M NaOAc (0.1× volume)和100 μl 的 冷 100% (vol/vol) 乙醇,涡旋混合样品。

(13)重复第4-8步的乙醇沉淀过程。

(14)用32μl的EB缓冲液重悬DNA,置于37°C温育5分钟以加速DNA溶解。

关键步骤:这一步的样品可以放于4°C过夜或者−20°C一周。

DAP-seq实验流程之末端加A

(15)加A反应,加入如下试剂进行加A反应

Component Amount per reaction (μl) Final amount/concentration
10× NEBuffer2 5
1 mM dATP 10 200 μM
Klenow Fragment 3 15 U

(16)轻柔混合并在室温下以3,000g的条件快速离心5秒,37°C孵育30分钟。

(17)样品清理,向样品中加入5 μl 的3 M NaOAc (0.1× volume)和100 μl 的 冷 100% (vol/vol) 乙醇,涡旋混合样品。

(18)重复第4-8步的乙醇沉淀过程。

(19)用30μl的EB缓冲液重悬DNA,置于37°C温育5分钟以加速DNA溶解。

(20)接头连接,加入如下试剂进行街头连接反应

Component Amount per reaction (μl) Final amount/concentration
T4 DNA Ligase 10× Buffer 5
30 μM Y adaptor 10 6 μM
T4 DNA Ligase (3 U/μl) 5 15 U

(21)轻柔混合并在室温下以3,000g的条件快速离心5秒,室温孵育3小时。

关键步骤:这一步的样品可以放于4°C过夜或者−20°C一周。

(22)样品清理和定量,向样品中加入5 μl 的3 M NaOAc (0.1× volume)和100 μl 的 冷 100% (vol/vol) 乙醇,涡旋混合样品。

(23)重复第4-8步的乙醇沉淀过程。

(24)用31μl的EB缓冲液重悬DNA,置于37°C温育5分钟以加速DNA溶解。

(25)取1μl样品测定DNA浓度,根据仪器说明书要求使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行测定。采用qPCR的方法来检测5ng的如上调整过分文库,以检测接头是否可以正确连接和文库是否可以扩增。

(26)(可选步骤)DNA扩增以去除甲基化并得到扩增的DAP文库。

2.DAP-seq 实验流程

(27)蛋白表达,在96孔PCR板内,根据说明书构建一个50μl体系的TNT(无细胞表达系统)表达反应,每个反应需要1μg pIX-Halo-ORF 质粒 DNA。

DAP-seq实验流程之蛋白表达

关键步骤:尽量不用每个反应不用400 ng 以下的质粒DNA。

(28)移液器轻柔吹吸混匀,30°C孵育2小时。

(29)Halo-fusion protein结合,向干净的1.5ml离心管内加入1ml的Magne HaloTag Beads。

(30)离心管放置在磁力架上,当所有磁珠被磁铁吸引溶液变得澄清时,将溶液吸走。

(31)从磁力架上取下离心管,用1ml的 PBS+NP40溶液洗涤磁珠,移液器吹匀混合

(32)重复第30和31步,总共洗涤磁珠3次。

(33)离心管放置在磁力架上,吸走溶液,取下离心管,加入0.95ml的PBS+NP40溶液,磁珠溶液总体积约1ml。

(34)使用多道移液器,向96孔PCR板的每个孔内加入10μl的洗涤过的磁珠。

关键步骤:注意等分磁珠时要充分混匀。

(35)向上述的每孔加入30μl的PBS+NP40,每孔内总体积为40μl。

(36)向上述每孔内加入40μl表达反应产物(第27步),剩余的10μl表达产物进行质量控制分析。该表达产物可以在4°C储存过夜或者−20°C保存一个月。

使用封板膜将96孔板密封,室温旋转反应1小时,可以使用上下倾覆的方式使磁珠保持溶液状态。

关键步骤:珠必须保持溶液状态,才能使结合充分。

(38)室温下以3,000g的条件快速离心5秒,使样品汇集在底部,将反应板放置在96孔磁力架上,上清转至一块干净的96孔PCR板内,按照Box3的方法在第58步进行质量控制分析。该表达产物可以在4°C储存过夜或者−20°C保存一周。

(39)蛋白洗涤,从磁力架上移下反应板,每孔加入85μl的PBS+NP40溶液,使磁珠自然地通过缓冲液落在孔底。

(40)将反应板放回磁力架,并移走上清。

(41)重复第39和40步,总共洗涤磁珠3次。

(42)DNA与蛋白结合,用40μl的PBS+NP40溶液重悬磁珠,每孔加入30-100 ng的DNA文库(第24步的DAP-seq或者第26步的ampDAP-seq),用EB缓冲液把总体积补至80μl。

(43)使用封板膜将96孔板密封,室温旋转反应1小时。

(44)DNA洗涤,反应板放置在磁力架上,并移走上清。

(45)重复第39和40步四次洗涤磁珠,最后一次洗涤,将缓冲液和磁珠,转移至一新板内。

关键步骤:①此步骤洗去未结合的DNA,以降低本底②转至新板也是为了降低本底。

(46)DNA恢复和扩增,反应板放置于磁力架上,移走上清,并用30μl的EB缓冲液重悬磁珠。

(47)封板膜密封反应板,98°C放置10分钟。

(48)立即冰上放置5分钟。

(49)在一个干净的PCR板内加入如下表的各个组分,每孔总体积25μl。

Component Amount per reaction (μl) Final amount/concentration
Water 9.5
5× Phusion HF Buffer 10
10 mM dNTPs 2.5 500 μM
Primer A (25 μM) 1 0.5 μM
Primer B (25 μM) 1 0.5 μM
Phusion DNA Polymerase (2,000 U/ml) 1 2 U

关键步骤:为便于后期分析,每孔需设置index.

(50)第48步的反应板室温3000g快速离心5秒,后放置在磁力架上,每孔取出25μl上清,放置于第49步的PCR反应板内。

(51)封板膜密封上述PCR反应板,混匀,室温3000g快速离心5秒,按照如下条件进行PCR扩增。

Cycle number Denature Anneal Extend
1 95 °C for 2 min
2 98 °C for 30 s
3–22 98 °C for 15 s 60 °C for 30 s 72 °C for 2 min
23 72 °C for 10 min

(52)合并和大小选择,每个样品取出5μl混合与1.5ml离心管内,余下样品密封保存,以备后续分析,−20°C可以保存6个月。

关键步骤:①混合的样品不能带有同样的index。②合并的样品数量取决于物种。

(53)每60μl的混合样品加12μl的6X上样染料,上样至两个打孔的1%琼脂糖凝胶中(含有0.005%溴化乙锭)同时上样100-bp ladder。

(54)在100V电压下电泳20分钟,直到目标DNA与引物二聚体分离。

(55)从凝胶上切下~200- to 400-bp 位置的DNA。

(56)使用胶回收试剂盒回收DNA,并用31μl的EB缓冲液洗脱。

(57)取1μl样品测DNA浓度。

(58)(可选择)蛋白表达和结合的分析,第36步和第38步的样品可以进行WB分析,验证表达和结合。

3.DAP-seq数据分析

DAP-seq实验流程之数据分析

(59)新一代测序,根据Illumina测序仪的操作说明将样品进行测序,我们发现75-bp和100-bp的单端读取运行都足够了。

(60)读取一致性。使用标准的短读映射软件如Bowtie2对齐FASTQ文件到参考基因组(引用28)。读取修剪和质量/重复读取过滤也可能是必要的,这取决于数据质量和参考基因组。

(61)使用peak calling软件,如MACS2(参考文献29)或GEM30,使用映射读文件(SAM或BAM格式)来识别峰值。如果你运行一个阴性控制样本,它可以用于背景减法在峰值呼叫程序。

(62)峰的分析。在基因组浏览器(如Integrative Genomics Viewer31)中检查映射读取和峰值文件(BED或窄峰格式),并将峰值与阴性对照样本进行比较。成功的DAP-seq实验通常会产生5%的波峰读数,并在背景中产生大量富集的波峰。如模因基序发现软件(http://meme-suite.org/)所产生的丰富基序可以与已知tf结合位点的综合数据库中的基序进行比较。

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