一、DAP-seq的原理是什么？实验流程概述？

可以分为以下三个阶段

转录因子的无细胞表达

1、将转录因子TF蛋白连上一个Halo 标签，这个标签大概33kd，通过无细胞表达的方式，将Halo-TF融合蛋白表达出来，再进一步借助Western Blot实验用Halo标签抗体检测是否成功表达。

基因组建库及亲和纯化

2、将基因组DNA提取出来，用非接触式超声破碎的方式打散成200bp左右的小的片段，然后跟无细胞表达的的转录因子的Halo-TF蛋白进行结合，洗脱下来的DNA片段加上A末端和index的接头，扩增建库后，进行二代测序。

数据分析

点我了解详细的DAP-seq的实验流程

二、什么情况下适合使用DAP-seq技术？

一般是这样的，我们有一个明确的转录因子需要研究，想了解这个转录因子在转录水平上可以调控哪一些蛋白的表达，这个时候呢，经典的方法是Chip-seq，但是手头上又没有这个转录因子对应的抗体，同时研究的物种还是植物，这个时候是非常适合用这个技术的。

三、Chip-seq做植物样本为什么比较困难呢（解释上个问题）？

Chip-seq是比较经典的方法，但植物样品做chip-seq成功率很低，主要有三个问题比较难以解决：

1、需要特定的生长时期的特定部位的组织，材料获得比较麻烦

2、TF表达量很低

3、需要chip级别的抗体

接下来我们具体解释下：

①首先，转录因子在植物的体内表达量是非常的微弱的，不仅微弱，还存在时空表达特性，例如某些调节开花的转录因子，其本身的表达代谢通路受其它蛋白或代谢物调节，只有在花期之前的某个特定时期，才在某些特定组织部位有高表达。也就是说，随便准备一份作为材料，实验大概率失败。要完成chip实验，必须要有足够多的TF，因此必须要增加转录因子的表达水平，这个时候我们就需要遗传转化来过表达转录因子蛋白。而很多非模式植物的遗传转化工作难度是非常大，即使是能够成功的遗传转化，所耗费的时间也是非常长的。

②其次，研究植物的转录因子，想做chip实验，就必须有这个转录因子对应的抗体，大多数情况下很难有商品化的抗体销售，这个时候我们就需要定制抗体，制备抗体的方式有很多种。但是无论用多肽作为抗原，还是用重组蛋白作为抗原获得的抗体都没办法保证chip的成功应用，只有通过多次实验失败才能归因到抗体无法达到chip级别，这个过程冗长而费力。

当然有些时候会在遗传转化过程中，给TF融合上一个标签，这个时候就不需要用针对TF的抗体了，只需要用标签抗体也可以完成chip实验，但是并不是所有的标签抗体都适合做Chip实验的，在这里我们建议使用3×flag标签，已经有实验证明这个抗体是好用的。

四、DAP-seq的注意点

①手头上的这个植株，它的基因组信息是不是完整，是否能提供带有注释文件的基因组的数据库，因为我们后面做数据分析的时候需要用到这个数据库，

②转录因子的蛋白序列是不是经过验证的，如果这个序列仅仅是通过第二代或第三代测序拿到的序列，建议通过PCR调取再验证一下。如果是预测的蛋白序列，将来的结果需要全部重新实验。

如果上面两点没问题，我们建议开始分析转录因子做DAP-seq的理论可行性

我们会对客户的转录因子和基因组信息进行项目可行性分析，我们一般会从六个方面开分析:

1、转录因子蛋白的是否有跨膜结构
2、亲疏水性
3、是否存在已知的典型和非典型结构域
4、转录因子是否存在理论的DNA结合位点
5、基因组的信息是否完整
6、转录因子蛋白表达定位预测

一般总分通过80分以上，我们才认为往后进行实验是比较靠谱的。

详情请参考《DAP-seq项目可行性分析》

五、DAP-seq如何设置对照，如何确保实验数据可信的？

DAP-seq实验中，我们一般会把库分成三份，其中一份空白库作为对照组，也就是input组，另外的两份会分别跟转录因子的融合蛋白进行结合实验，结合下来的产物建库测序，最终拿到的数据应该是三组数据。我们认为：只有在两个重复的样品中都能检测到的片段才是有效的片段，同时，这个有效的片段的峰值应该比input组上面的峰值高两倍以上。

六、委托我司进行技术服务，交付哪些数据？

我们最终会给客户提供一个完整的实验报告，包含转录因子原核表达载体构建报告，无细胞表达载体的构建报告，无细胞表达的鉴定（这里面包含了western blot的图片），另外会提供建库之后DNA片段碎片的回收片段的电泳图片，建库后拿到二代测序结果，我们的测序原始结果也会通过云盘的形式发给客户。需要我们做生物信息学分析的，我们会对获得的片段进行go分析以及KEGG分析，还有热力点分热力图分析等，把测得的片段在基因组上面的分布比例描述清楚。

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