1．CUT&Tag的原理是什么？

在CUT＆Tag中，用磁珠结合蛋白，并对细胞膜进行通透处理，使得特异性抗体进入细胞核特异结合靶蛋白，然后将蛋白-Tn5转座酶融合蛋白结合在一起。转座酶的激活导致染色质在接近蛋白质结合位点处被切割，同时添加了NGS衔接子DNA序列，并有效地产生了具有高分辨率和极低背景的片段文库。从活细胞到可测序的文库的所有步骤均可在台式单管或高通量管线中的微孔中进行，整个过程可在一天之内完成。

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2．CUT&Tag一般适用于哪些类型蛋白质的研究？能否应用于异染色质上的位点？

与ChIP-seq相同，CUT&Tag主要用于全基因组范围内的DNA-蛋白质结合位点分析和组蛋白修饰研究，包括存在于异染色质区域的蛋白，如存在于染色质压缩缠绕区的H3K27me3。当用于研究转录因子时，转录因子的丰度较低会导致其文库产量也相比组蛋白修饰研究的文库产量低，但同样可以获得好的测序及数据分析结果。

3．ConA磁珠结合细胞原理是什么？

磁珠表面的刀豆蛋白可以结合细胞膜或细胞核膜表面的糖蛋白，从而起到固定细胞作用。

4．关于对照

一般来说，CUT&Tag 会有两种对照：阳性对照一般选择与基因组DNA相互作用较高的蛋白，例如组蛋白；阴性对照可以使用不加入一抗而正常加入二抗和Tn5转座酶的体系，查看是否存在Tn5转座酶乱切的情况，或者也可加入非特异性的IgG作为阴性对照。

5．实验中，在孵育酶、片段化时，是否可以改变NaCl浓度？

通常情况下，不建议改变NaCl浓度，降低浓度，会增强转座酶的非特异性打断，增加浓度，则会降低信号强度。对于专门的组蛋白修饰研究，适当提升浓度，可以减弱开放区信号对结果的干扰，比如 将10×CTB母液当作9×使用。

6．在DNA提取或PCR产物纯化过程中，磁力架磁力较弱，不能充分吸附磁珠，怎么办？

市面上部分磁力架的吸附力不足，吸液时磁珠会随着液面下滑，干扰吸取上清，这种情况，需要更换 磁力较强的磁力架。如果短期内无法获得强吸附磁力架，可以使用离心法，将磁珠离心至底部，然后再吸取上清。

7．为什么CUT&Tag的文库分布一般控制在200~1000 bp之间?

对于组蛋白修饰来说，因为有核小体的阻隔，文库偏长，目前生信分析时普遍选用20~700 bp的insert片段，加上两端的测序元件序列约140 bp，文库片段区间为160-840 bp；转录因子、DNA结合蛋白的文库片段偏短，生信分析时可以 侧重20~550 bp的insert片段；对于大型的复合蛋白，因空间位阻的存在，可能会偏向于大片段；故文库片段的大小跟靶蛋白的特性相关，在实验早期阶段的生信分析时，可以考虑分析不同长短区间的文库对结果的贡献率，去除低贡献的片段，从而达到最佳效果。文库片段大小的上限可以通过减少或增加延伸时间来调整。

8．最后的文库太短，只有200~300bp，没有长片段是什么原因？

通常是在DNA提取时，乙醇漂洗不充分，残液较多，干扰了后续扩增，可以采取以下措施：
1) 如果EP管壁上沿有残液，可先用移液器吸去，再用80%乙醇吹洗；
2) 在提取DNA时，200 μL EP管， 80%乙醇漂洗体积为200 μL，而1.5 mL EP管的漂洗体积需要为1 mL；
3) 晾干前，把EP管底的残液吸去干净。

9．CUT&Tag的实验样本，二代测序上机应该如何选择？测序数据量怎么确定？

推荐双端测序，2×50 pb、2×100 bp、2×150 bp均可；数据量3~20M reads，根据物种基因组大小调整；例如选择双端测序2×150 bp，对应1~6G数据量；对于人源细胞常规的组蛋白修饰，仅需 3~5M的测序量就能得到高分辨率的全基因图谱。细胞数量偏少或靶蛋白丰度较低时，通常需要较多 的扩增循环才能满座上机需求，会造成重复序列比例上升，这种情况下需要适当提高测序数据量。

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