CUT&Tag超详细实验流程

与经典ChIP-seq不同，CUT&Tag细胞未用甲醛固定，也不需要进行超声处理，下面就详细介绍了CUT&Tag的实验流程，包括细胞与磁珠结合、结合一抗、pA-Tn5衔接子转座体、标签化、DNA提取、PCR、高通量测序。

试剂
洋地黄皂苷 (5%)：将50 mg洋地黄皂苷溶解在1 ml DMSO中。 注意：洋地黄皂苷有毒，应特别注意称量粉末。处理任何数量的洋地黄皂苷时，请使用完整的个人防护装备，包括口罩，实验室外套和手套。请注意，DMSO可以穿透皮肤。
结合缓冲液 ：将400μL 1M HEPES pH 7.5、200μL 1M KCl，20μL 1M CaCl2和20μL 1M MnCl2 混合，并用dH2O使最终体积达到20 mL。将缓冲液在4°C下保存6个月。
洗涤缓冲液：混合1 mL 1M HEPES pH 7.5、1.5 mL 5M NaCl，12.5μL 2M亚精胺，用dH2O 使最终体积达到50 mL ，并添加1片罗氏完全蛋白酶抑制剂EDTA游离片。将缓冲液在4°C下保存最多1周。
Dig-wash缓冲液 ：将400μL 5％的Digitonin与40 mL Wash缓冲液混合。将缓冲液在4°C下最多保存2天。
抗体缓冲液 ：将8μL 0.5M EDTA和6.7μL 30％BSA与2 mL Dig-wash缓冲液混合，并置于冰上。
Dig-300 缓冲液：混合1 mL 1M HEPES pH 7.5、3 mL 5M NaCl和12.5μL 2M亚精胺，用dH2O使最终体积达到50 mL ，并加入500μL 5％ Digitonin和1罗氏完全蛋白酶抑制剂无EDTA片剂。将缓冲液在4°C下最多保存2天。
标记缓冲液：混合5 mL Dig-300缓冲液和50 µL 1M MgCl2 。
Tn5-衔接子复合物的形成： ①将Mosaic末端-衔接子A（ME-A）和Mosaic末端-衔接子B（ME-B）寡核苷酸分别与Mosaic末端-反向寡核苷酸退火。 ②将16 µL的100 uM等摩尔的预退火ME-A和ME-B寡核苷酸混合物与100 µL的5.5 µM蛋白A-Tn5融合蛋白混合。 ③将混合物在旋转平台上于室温下孵育1小时，然后在-20°C下保存。

一．细胞与磁珠结合

1.轻轻地重悬并抽出足够的ConA珠浆，这样每个最终样品将有10μL。
2.将170 µL ConA珠状浆液转移到2 mL管中的1.6 mL结合缓冲液中，并通过移液进行混合。将试管放在磁力架上进行清理（30秒钟至2分钟）。
3.完全取出液体，然后从磁铁架上取下。加入1.5 mL结合缓冲液，通过移液混合，从盖子和侧面用微量离心机快速脉冲除去液体。
4.重悬于1.7 mL结合缓冲液（每个样品100μL）中并保持直到细胞被清洗并准备就绪。
5.关键步骤：细胞透化之前的所有步骤均在室温下进行，以最大程度地降低细胞受到的压力。我们建议避免在重悬和剧烈涡旋过程中出现气穴现象。
在室温下收获新鲜的培养物并计数细胞。
6.在室温下离心3分钟，并抽出液体。
7.在室温下重悬于至少1体积的洗涤缓冲液中，在室温下离心3分钟，并抽出液体。
8.重悬于1.5 mL洗涤缓冲液中，并转移至2 mL管中。轻轻涡旋（1100 rpm）时，滴加珠状浆料。放置在旋转器上5-10分钟。
9.快速旋转以除去盖子上的液体后，将试管放在磁铁架上以清除并取出液体。

二．结合一抗

1.将细胞重悬于800 µL冰冷抗体缓冲液中，轻轻摇晃，置于冰上，分成16个1.5 mL试管，每个试管50 µL。
2.将每种抗体在50 µL抗体缓冲液中混合，并加入样品等分试样，对每个最终样品进行轻柔涡旋。
3.放在4°C的nutator上，在4°C孵育过夜至几天。或者，在室温下拧紧2小时。摇动时，液体应留在管子的底部和侧面。
关键步骤：要评估该程序是否成功而无需准备文库，请并行加入阳性对照抗体和可选的阴性对照抗体。
4.快速旋转以除去盖子上的液体（＜100 xg）后，将每个管子放在磁体支架上以清除并拉出液体。
5.将二抗1:100混合在Dig-wash缓冲液中，向每个样品中注入50µL，同时轻轻旋转，以使溶液从侧面除去珠子。
6.将试管放在室温的nutator上30–60分钟。
7.快速旋转后，将试管放在磁铁架上以清除并抽出液体。将微珠重悬于200 µL Dig-wash缓冲液中。
8.重复步骤7。

三．pA-Tn5衔接子转座体

1.在Dig-300缓冲液中混合pA-Tn5衔接子复合物至终浓度为1：250，每个样品100 µL。
2.将试管放在磁体支架上，以清除并除去液体。
3.加入100 µL pA-Tn5混合物，同时轻轻涡旋以使溶液去除大部分或所有珠子。Dig-300缓冲液（300 mM NaCl）中可能会出现小的团块，但这不会影响孵育或洗涤的效率。
4.将试管在室温下置于nutator上1小时。
5.快速旋转后，将试管放在磁铁架上以清除液体。
6.加入800 µL Dig-300缓冲液。颠倒10x或轻轻涡旋以使溶液去除大部分或所有珠子。
7.重复步骤5-6两次。

四．标签化

1.快速旋转后，将管子放在磁体支架上以清除并拉出液体。
2.加入300 µL Tagmentation缓冲液，同时轻轻涡旋。
3.在37ºC下孵育1小时。

五．DNA提取

1.要终止标签化反应，在室温下向每个样品中添加10 µL 0.5M EDTA，3 µL 10％SDS和2.5 µL 20 mg / mL蛋白酶K。
2.在50ºC或37ºC下孵育1小时过夜以进行消化。
3.添加300μL PCI，并通过全速涡旋混合约2 s。
4.转移到锁相管中，在室温下以16,000 xg离心5分钟。
5.加入300μL氯仿，倒置约10倍进行混合。允许分开。
6.移液至装有750 µL 100％乙醇的新管中，上下移液混合以除去水层。
7.在冰上冷却并在4°C下离心15分钟。
8.小心地倒出液体并沥干纸巾。通常没有可见的颗粒。
9.在1 mL 100％乙醇中冲洗，并在4°C下以16,000 xg的速度离心1分钟。
10.小心地倒出液体并沥干纸巾。空气干燥。沉淀干燥后，溶于25-30μL 1mM Tris-HCl （pH8.0 ） ，0.1mM EDTA中。

六．PCR

1.通过PCR扩增DNA，以插入高通量测序指标。
关键步骤：为了最大程度地减少大DNA片段和过量引物的影响，PCR循环最好为12-14个循环。

七．PCR后处理

1.管冷却后，从循环仪中取出并添加1.1体积（55 µL）的Ampure XP珠，并在充满时短暂涡旋。
2.快速旋转，在室温下静置10分钟。
3.放置在磁铁上并使其清除，然后小心取出液体。在磁铁上且不干扰磁珠的情况下，加入1 mL 80％乙醇。
4.用移液管将液体移至试管底部，然后加入1 mL 80％的乙醇。
5.取出液体并用20 µL移液器除去残留的液体，然后干燥4-5分钟。
6.从磁铁架上取下，加入25 µL 10 mM Tris-HCl（pH8.0），并充分涡旋。
7.5分钟后，将其放在磁铁架上并使其清除。
用移液器将液体移至新的试管中。

八．DNA测序和数据处理

以上就是我们总结的关于CUT&Tag的详细实验流程。

相关服务