CUT&Tag超详细实验流程

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CUT&Tag超详细实验流程

与经典ChIP-seq不同,CUT&Tag细胞未用甲醛固定,也不需要进行超声处理,下面就详细介绍了CUT&Tag的实验流程,包括细胞与磁珠结合、结合一抗、pA-Tn5衔接子转座体、标签化、DNA提取、PCR、高通量测序。

试剂
洋地黄皂苷 (5%):将50 mg洋地黄皂苷溶解在1 ml DMSO中。
注意:洋地黄皂苷有毒,应特别注意称量粉末。处理任何数量的洋地黄皂苷时,请使用完整的个人防护装备,包括口罩,实验室外套和手套。请注意,DMSO可以穿透皮肤。
结合缓冲液 :将400μL 1M HEPES pH 7.5、200μL 1M KCl,20μL 1M CaCl2和20μL 1M MnCl2 混合,并用dH2O使最终体积达到20 mL。将缓冲液在4°C下保存6个月。
洗涤缓冲液:混合1 mL 1M HEPES pH 7.5、1.5 mL 5M NaCl,12.5μL 2M亚精胺,用dH2O 使最终体积达到50 mL ,并添加1片罗氏完全蛋白酶抑制剂EDTA游离片。将缓冲液在4°C下保存最多1周。
Dig-wash缓冲液 :将400μL 5%的Digitonin与40 mL Wash缓冲液混合。将缓冲液在4°C下最多保存2天。
抗体缓冲液 :将8μL 0.5M EDTA和6.7μL 30%BSA与2 mL Dig-wash缓冲液混合,并置于冰上。
Dig-300 缓冲液:混合1 mL 1M HEPES pH 7.5、3 mL 5M NaCl和12.5μL 2M亚精胺,用dH2O使最终体积达到50 mL ,并加入500μL 5% Digitonin和1罗氏完全蛋白酶抑制剂无EDTA片剂。将缓冲液在4°C下最多保存2天。
标记缓冲液:混合5 mL Dig-300缓冲液和50 µL 1M MgCl2 。
Tn5-衔接子复合物的形成:
①将Mosaic末端-衔接子A(ME-A)和Mosaic末端-衔接子B(ME-B)寡核苷酸分别与Mosaic末端-反向寡核苷酸退火。
②将16 µL的100 uM等摩尔的预退火ME-A和ME-B寡核苷酸混合物与100 µL的5.5 µM蛋白A-Tn5融合蛋白混合。
③将混合物在旋转平台上于室温下孵育1小时,然后在-20°C下保存。
实验流程图


一.细胞与磁珠结合

1.轻轻地重悬并抽出足够的ConA珠浆,这样每个最终样品将有10μL。
2.将170 µL ConA珠状浆液转移到2 mL管中的1.6 mL结合缓冲液中,并通过移液进行混合。将试管放在磁力架上进行清理(30秒钟至2分钟)。
3.完全取出液体,然后从磁铁架上取下。加入1.5 mL结合缓冲液,通过移液混合,从盖子和侧面用微量离心机快速脉冲除去液体。
4.重悬于1.7 mL结合缓冲液(每个样品100μL)中并保持直到细胞被清洗并准备就绪。
5.关键步骤:细胞透化之前的所有步骤均在室温下进行,以最大程度地降低细胞受到的压力。我们建议避免在重悬和剧烈涡旋过程中出现气穴现象。
在室温下收获新鲜的培养物并计数细胞。
6.在室温下离心3分钟,并抽出液体。
7.在室温下重悬于至少1体积的洗涤缓冲液中,在室温下离心3分钟,并抽出液体。
8.重悬于1.5 mL洗涤缓冲液中,并转移至2 mL管中。轻轻涡旋(1100 rpm)时,滴加珠状浆料。放置在旋转器上5-10分钟。
9.快速旋转以除去盖子上的液体后,将试管放在磁铁架上以清除并取出液体。

二.结合一抗

1.将细胞重悬于800 µL冰冷抗体缓冲液中,轻轻摇晃,置于冰上,分成16个1.5 mL试管,每个试管50 µL。
2.将每种抗体在50 µL抗体缓冲液中混合,并加入样品等分试样,对每个最终样品进行轻柔涡旋。
3.放在4°C的nutator上,在4°C孵育过夜至几天。或者,在室温下拧紧2小时。摇动时,液体应留在管子的底部和侧面。
关键步骤:要评估该程序是否成功而无需准备文库,请并行加入阳性对照抗体和可选的阴性对照抗体。
4.快速旋转以除去盖子上的液体(<100 xg)后,将每个管子放在磁体支架上以清除并拉出液体。
5.将二抗1:100混合在Dig-wash缓冲液中,向每个样品中注入50µL,同时轻轻旋转,以使溶液从侧面除去珠子。
6.将试管放在室温的nutator上30–60分钟。
7.快速旋转后,将试管放在磁铁架上以清除并抽出液体。将微珠重悬于200 µL Dig-wash缓冲液中。
8.重复步骤7。

三.pA-Tn5衔接子转座体

1.在Dig-300缓冲液中混合pA-Tn5衔接子复合物至终浓度为1:250,每个样品100 µL。
2.将试管放在磁体支架上,以清除并除去液体。
3.加入100 µL pA-Tn5混合物,同时轻轻涡旋以使溶液去除大部分或所有珠子。Dig-300缓冲液(300 mM NaCl)中可能会出现小的团块,但这不会影响孵育或洗涤的效率。
4.将试管在室温下置于nutator上1小时。
5.快速旋转后,将试管放在磁铁架上以清除液体。
6.加入800 µL Dig-300缓冲液。颠倒10x或轻轻涡旋以使溶液去除大部分或所有珠子。
7.重复步骤5-6两次。

四.标签化

1.快速旋转后,将管子放在磁体支架上以清除并拉出液体。
2.加入300 µL Tagmentation缓冲液,同时轻轻涡旋。
3.在37ºC下孵育1小时。

五.DNA提取

1.要终止标签化反应,在室温下向每个样品中添加10 µL 0.5M EDTA,3 µL 10%SDS和2.5 µL 20 mg / mL蛋白酶K。
2.在50ºC或37ºC下孵育1小时过夜以进行消化。
3.添加300μL PCI,并通过全速涡旋混合约2 s。
4.转移到锁相管中,在室温下以16,000 xg离心5分钟。
5.加入300μL氯仿,倒置约10倍进行混合。允许分开。
6.移液至装有750 µL 100%乙醇的新管中,上下移液混合以除去水层。
7.在冰上冷却并在4°C下离心15分钟。
8.小心地倒出液体并沥干纸巾。通常没有可见的颗粒。
9.在1 mL 100%乙醇中冲洗,并在4°C下以16,000 xg的速度离心1分钟。
10.小心地倒出液体并沥干纸巾。空气干燥。沉淀干燥后,溶于25-30μL 1mM Tris-HCl (pH8.0 ) ,0.1mM EDTA中。

六.PCR

1.通过PCR扩增DNA,以插入高通量测序指标。
关键步骤:为了最大程度地减少大DNA片段和过量引物的影响,PCR循环最好为12-14个循环。

七.PCR后处理

1.管冷却后,从循环仪中取出并添加1.1体积(55 µL)的Ampure XP珠,并在充满时短暂涡旋。
2.快速旋转,在室温下静置10分钟。
3.放置在磁铁上并使其清除,然后小心取出液体。在磁铁上且不干扰磁珠的情况下,加入1 mL 80%乙醇。
4.用移液管将液体移至试管底部,然后加入1 mL 80%的乙醇。
5.取出液体并用20 µL移液器除去残留的液体,然后干燥4-5分钟。
6.从磁铁架上取下,加入25 µL 10 mM Tris-HCl(pH8.0),并充分涡旋。
7.5分钟后,将其放在磁铁架上并使其清除。
用移液器将液体移至新的试管中。

八.DNA测序和数据处理

高通量测序


以上就是我们总结的关于CUT&Tag的详细实验流程。






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