IHC常见问题解析

1、出现非特异性背景染色怎么办？

(1)冲洗不充分      解决：每步冲洗3×5
(2)组织中含过氧化物酶未阻断    解决：可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长
(3)组织中含内源性生物素     解决：正常非免疫 动物血清再封闭
(4)血清蛋白封闭不充分      解决：延长血清蛋白封闭时间

2、脱片产生的原因有哪些？

（1）组织切的不好，切的不均匀。
（2）时间短，温度不够。
（3）操作不规范，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。
（4）抗原修复的时候高压时间过长了。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片。
（5）使用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。

3、染色阴性怎么办？

（1）操作步骤错误，重新试验，设立阳性对照
（2）组织中无抗原，设立阳性对照片，以验证实验结果
（3）一抗与二抗种属连接错误，仔细确定一抗与二抗种属无误

4、苏木素复染后氨水返蓝怎么做?

返蓝可以用碱性溶液（PBS/Na2HPO4/淡氨水）或45度温水. 冷水蓝化均可。一般蓝化5~10 min。

5、如何做到充分脱蜡？

（1）目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，脱蜡力强，脱蜡时间较短；

（2）脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂来调整。如果在夏天气温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5min就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20min或更长。

（3）当天切的切片，烧烤2小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程，如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温10-20min，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，效果更好。

6、内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？

（1）一般3%过氧化氢灭活时间短点，10 min左右即可；而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30 min。
（2）用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可很好的保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片。
（3）现用现配原则，配好后4度避光保存。

7、DAB显色时间如何把握？

（1）DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；

（2）DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；

（3）此外，如果很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；

（4）DAB显色时间很长，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短；另一方面就是封闭时间过长。

8、如何最大限度地降低组织非特异性染色？

（1）缩短一抗/二抗孵育时间，稀释抗体。这非常重要。

（2）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；

（3）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。

（4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；

（5）缩短DAB孵育时间以及降低DAB浓度/过氧化氢浓度等；

（6）适当增加PBS冲洗次数以及浸洗时间，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗非常重要；

（7）防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色。

9.免疫组化实验中苏木素复染时间如何把握？

（1）苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧以及目标抗原的定位等情况，一般数秒到数分钟不等。

（2）盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒后快速拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。

（3）如果分化的颜色过浅，可以复置于苏木素中染色。

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