常用胶体金制备方法

(一)胶体金的性状

    胶体金的性状主要取决于金颗粒的直径、吸收光谱及其稳定性。胶体金的吸收光谱为一吸收波峰,一般在510~550nm可见光谱范围之间,吸收波长随金颗粒直径增大而增加，同时产生从淡橙黄色到蓝紫色，乃至棕褐色的颜色变化。胶体金颗粒在5~20nm之间，吸收波长为520nm,呈葡萄酒红色;20~40nm之间，主要吸收波长530nm的绿光，溶液呈深红色;60nm的胶体金溶液主要吸收波长为600nm的橙黄色光，金溶液呈蓝紫色。如金颗粒形状不规则并出现凝聚,则可导致吸收波峰变宽口。测量光密度可以估算金探针制备不同阶段胶体金的产量，而透射电镜直接观测则是精确判定胶体金颗粒直径及均匀度的最佳手段。

    胶体金颗粒由吸附周围离子，以静电排斥作用来维持胶体的稳定性。维持胶体状态的各种条件一旦破坏，即导致胶体粒子的凝集和絮状物形成。胶体金稳定性主要取决于电解质的影响、胶体颗粒大小以及浓度等。少量电解质即可使溶胶聚沉。金颗粒越小，则越稳定，越不易受电解质的干扰而凝集，丽浓度增大则易发生凝集。应用稳定剂可增强胶体金的稳定性。常用的有牛血清白蛋白(BSA), 聚乙二醇(分子量20000)、卵白蛋白、聚厶烯胺吡烷酮、明胶等，吐温20、淀粉、聚葡糖等也可提高胶体金的稳定性。

(二)制备方法

    胶体金的制备主要采用化学还原法，即向氯化金水溶液内加入各种还原剂，使金离子聚合成胶体金。还原法可认为是一个结晶过程，颗粒的大小取决于还原剂所致晶核形成速度及结晶生长速度。常用的还原剂有白磷、抗坏血酸、柠檬酸、鞣酸、硼氢化钠、过氨化氢及乙醇等。现将目前常用的几种还原剂制备方法介绍如下:

1.准备与要求

    (1)使用的玻璃器皿应非常清洁。玻璃表面的性质对还原过程的起动有重要作用，如不清洁则影响起动过程，干扰胶体金颗粒生成，造成颗粒大小不一或液体混浊。因此.所用器皿均需经过酸洗、硅化。也可不经硅化而采用器瓜专用化，即将洗净的器皿直接制备胶体金。用第一次制备的胶体金稳定玻璃器皿表面，然后弃去;或用已制备的胶体金涂布洗静的玻璃器皿表面，再用双蒸水洗净，专用于制备同一直径的胶体金。

    (2)所有配制试剂用水均应为双蒸或三蒸去离子水，并均应注意容器洁净，任何杂质和尘粒都会干扰胶体金的生成。

    (3)所用试剂，尤其是还原剂，称量要精确。因金颗粒的直径主要取决于还原剂的浓度。

    (4)氯化金板易吸潮而不便称量，故配制氯化金水溶液吋，可將整个瓶内的含量(lg)一次溶解配成1%的水溶液。置冰箱内可保存数月。

2.柠檬酸三钠还原法

    (1)取约100ml双蒸水，放入带搅拌棒的洁净锥瓶内，煮沸后弃去(目的为最后一次清洁)。

    (2)取247.5ml新鲜制备的双蒸水，加热至沸腾;

    (3)加入2.5ml 1% HAuCl₄,加速搅拌;

    (4)取7.5ml1%柠檬酸三钠,迅速加入沸腾的金溶液中,继续搅拌煮沸，30min即可。

    (5)电镜检测金颗粒直径。按此法所制金颗粒直径约15nm，置灭菌容器中4℃下可贮存半年。

     应用柠檬酸三钠还原法的优点是通过改变柠檬酸三钠的加入量，可制备不同直径(15~ 150nm)的胶体金颗粒。基本规律为:柠檬酸三钠用量越少，胶体金颗粒直径越大(表1)。

制备不同直径胶体金颗粒所需柠檬酸三钠剂量表
0.01%氯化金(ml)	0.1%柠檬酸三钠(ml)	金颗粒平均直径(nm)
250	7.5	±15
250	3.75	±30
250	2.50	±50
250	1.90	±60

    上述剂量与直径的关系是相对的，各实验室因条件不同可能有所变化，精确剂量需通过预实验来判定。

3.柠檬酸三钠改良法

    此法通过将氯化金溶液加入煮沸的柠檬酸钠溶液中(而不是将柠檬酸钠加入金溶液)，可制备直径8nm~10nm较均一的胶体金颗粒，增加柠檬酸钠的剂量可制备直径12.5nm以下金颗粒。此法宜采用250ml容量制备。

    (1)取新鲜制备的多蒸水247.5ml置于洁净锥瓶内煮沸;

    (2)加入1%柠檬酸三钠15ml,继续煮沸5min;

    (3)加速搅拌的同时，迅速加入1%HAuCl₄ 2.5ml,继续煮沸15min;

    (4)冷却，无菌状态下贮存。

    (5)电镜检测金颗粒直径。

4.鞣酸-柠檬酸钠还原法

    由于白磷还原法中所用白磷有毒，尤其是与乙醚联合使用时具有一定的危险性，故建立此法替代白磷还原法制备直径5nm胶体金颗粒。

    (1)取0.01%HAuCl₄ 100ml煮沸;

    (2)搅拌下迅速加入2. 45ml柠檬酸三钠-鞣酸混合液(1%柠檬酸三钠2ml, 1%鞣酸0.45ml);

    (3)继续加热15min.冷却备用。

    (4)电镜检测金颗粒。

5.鞣酸-柠檬酸钠改良法

    此法在上述Mulpfordt法基础上进行了改良，主要通过鞣酸用量的变化来控制胶体金颗粒直径，从而达到制备不同直径的胶体金颗粒。但鞣酸的用量不能太高，否则会影响蛋白质生物活性。应用此法制备的金颗粒直径较均匀，是目前最常用的方法之一。

    (1)1ml 1%HAuCl₄水溶液加入79ml双蒸水中混匀，为A液;

    (2)4ml 1%柠檬酸三钠、0.7ml 1%鞣酸和0. 2ml 0.1M K₂CO₃混合后加双蒸水至20ml，为B液;

    (3)A液和B液同时于水浴内加热至60℃，并保持恒温;

    (4)搅拌下将B液迅速加入A液中，继续加热搅拌至溶液呈亮红色(约5~ l0min)。

    (5)此法所制备的胶体金颗粒直径为5nm,如将1%鞣酸用量变化，从0.01~4ml,则金颗粒可从15nm减至3.3nm (表2)。

鞣酸-柠檬酸钠改良法试剂用量及金颗粒直径关系
直径(nm)	A液(ml)			B液(ml)
	1%氯化金	双蒸水	1%鞣酸	1%柠檬酸钠	0.1mol碳酸钾	双蒸水
3.3	1	79	4	4	0.2	11.8
5	1	79	0.7	4	0.2	15.1
10	1	79	0.1	4	0.025	15.875
15	1	79	0.01	4	0.0025	15.987

6.乙醇超声波还原法

    (1)1%HAuCl₄水溶液0.1ml加入50ml双蒸水中;

    (2)以0.2mol K₂CO₃调pH至7.2， 再加入0. 5ml乙醇;

    (3)以20KC、125W超声波探头浸入溶液振荡，由此法制备的胶体金颗粒直径为6~10nm。

(三)胶体金颗粒电镜检测法

    上述各法所制备的胶体金须经鉴定后方可使用，利用透射电镜直接观察胶体金颗粒是精确判定金颗粒形态，直径及均匀度的最佳方法。此法多采用带Formvar膜并经多聚L-赖氨酸处理的载网，以防止人为所致金颗粒的聚集。过氧化氢酶结晶体可用作放大照片测定时的参照物。金颗粒的质量标准不仅是平均直径，且应包括差异率和95%的分布范围等，具体操作方法如下:

    1.制备0.01% poly-I-lysine (MW 70 000)水溶液，调pH至7.4，贮存于一20℃。每次用前低温离心10, 000g 15min。

    2.带膜载网膜面朝上，滴poly-I-lysin于载网上，孵育10min;

    3.双蒸水喷洗载网，剩余水份经滤纸吸干;

    4.取一滴胶体金水溶液滴于干燥后的载网上，孵育10min;

    5.双蒸水冲洗;

    6.滤纸吸去剩余水分，并使其彻底干燥;

    7.过氧化氢酶结晶体经负染色，作为每次最后放大倍数(电镜放大倍数+照像放大.倍数)测量的参照物。

    8.如需更精确者，可使用有关仪器对其圆度、偏心率等进行测定。

     统计学处理需测100个以上金颗粒，计算其平均直径及标准差来反映颗粒的大小和均匀程度。

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