胶体金标记探针的制备

    胶体金作为标记物主要是根据其物理性状和可被大分子所稳定的特性。其稳定性是由于将大分子物质吸附于金颗粒表面。所谓胶体金标记蛋白质的过程，实际上即为蛋白质被吸附到胶体金颗粒表面而结合的过程，由此而制备成标记探针，并使胶体金处于稳定状态。关于吸附机理，目前仍不十分清楚。一般认为是静电吸引的非共价键结合。蛋白质吸附受颗粒大小、离子浓度、蛋白质浓度和分子量的影响。

     由于胶体金对蛋白质的吸附主要取决于最适pH值，故胶体金pH值的调整非常重要。一般而言，在接近被标记蛋白等电点或略偏碱的pH条件下吸附力最强，两者易形成牢固的复合物而获得稳定的探针。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会导致吸附力下降，稳定性破坏而产生聚集。

(一)待标记蛋白质和金溶液的准备

    一般应将蛋白质溶解在高度稀释的氯化钠溶液(0.005M，pH7.0)和缓冲液或双蒸水中。对电解质含量过高的蛋白质溶液，可用蒸馏水或0. 005mol NaCl (pH7.0) 溶液透析。用蒸馏水透析时间要短，以免影响蛋白质的活性。标记前宜将蛋白溶液以100000g离心1h,除去蛋白聚合物。单克隆和多克隆IgG易形成单聚体和双聚体，导致金颗粒聚集。在制备过程中，必须十分注意任何时候均勿使其浓度超过1mg/ml,可用凝胶色谱法分离出单聚体IgG，再经2mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)透析，可使其重新溶解。

     胶体金的pH值可用0.1molK₂CO₃或0.1NHCl进行调节。因胶体金溶液可能损害pH测定仪的探头，一般采用pH试纸测定其pH值。对IgG的测定较为特殊，因不论是亲和层析纯化或色谱纯化的抗体均展示一个范围较宽的等电点。有人认为pH9.0可作为亲和层析纯化的IgG吸附胶体金颗粒的最佳pH值，但不包括经离子交换色谱法制备的IgG片段，因此法制备可改变IgG的等电点范围。表1为制备不同蛋白质一胶体金复合物的最佳pH值。

制备不同蛋白质-胶体金复合物的最佳pH值
蛋白质	pH
IgG	9.0
离子交换的IgG片段	7.6
亲和层析抗体	8.2
单克隆抗体	8.2
F(ab′)2	7.2
SPA	5.9-6.2
蓖麻子植物血凝素Ⅰ	8.0
蓖麻子植物血凝素Ⅱ	8.0
花生凝集素	6.3
Helix Pomatia Lectin	7.4
大豆凝集素	6.1
Lens Cularis Lectin	6.9
四边形叶莲花凝集素	6.3
荆豆凝集素I	6.3
Bandeirae Simplicifola Lectin	6.2
甘露聚糖	7.0
过氧化物酶	7.2-8.0
类卵粘蛋白	4.8
血浆铜蓝蛋白	7.0
脱唾液酸胎球蛋白	6.0-6.5
小牛血清白蛋白	6.0-6.5
牛血清白蛋白	5.2-5.5
牛血清白蛋白结合肽	4.0-4.5
牛血清白蛋白结合胰岛素	5.3
霍乱毒素	6.9
破伤风毒素	6.9
RNA酶	9.0-9.2
DNA酶	6.0
低密度脂蛋白	5.5
α2-巨球蛋白	6.0
抗生物素蛋白	10.0-10.6
链霉抗生物素蛋白	6.4-6.6

(二)稳定胶体金最适蛋白剂的测定

    确定蛋白质或其它大分子物质的最小加入量对于制备稳定的金探针是非常必要的这一剂量可充分保护一定容量的胶体金免于絮集。测量其最小保护剂量必须在最佳pH值和离子浓度的情况下进行。如果不知其最佳pH值,可在蛋白质非变性状态下分析等电聚焦来判断其等电点，或通过不同pH下蛋白吸附的浓度变化曲线来判定。

     1.分光光度计测定法     抗体经高速离心后， 取一定量以2mmol硼酸盐缓冲液＜pH9.0)稀释、直径20nm胶体金，蛋白质稀释至0. 2mg/ml; 5nm者，稀释至0. 75mg/ml。稀释后的抗体与其它有关试剂按下表逐项操作(表2)。

分光光度计测定稳定胶体金最小蛋白计量
试剂	试验管										对照管
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	1
抗体(ul)	100	90	80	70	60	50	40	30	20	10	H2O（替代抗体）
2mM硼酸缓冲液(ul)	0	10	20	30	40	50	60	70	80	90	100
胶体金pH9.0(ml)	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
摇匀，放置2min
10%NaCl(ul)	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	0
摇匀，放置5min后，OD580nm测定

    以OD值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标做一曲线,取曲线与横轴接近那一点的蛋白质用量即为最小保护剂量。在此基础上再加10%~20%即为稳定胶体金的蛋白质实际用量。

     2.试管观测法

    (1)取8~10支试管，分别加入1m1胶体金溶液;

    (2)将待测蛋白质逐级稀释后(稀释范围一般从40μg~5μg递减)，各取等体积稀释液顺序加入。上述含胶体金液试管中，另设一不加蛋白质的对照管。如不知待测蛋白质浓度时，亦可按一定比例(如1 ; 10， 1 : 20等)遂管稀释配制梯度浓度，只要能选出颜.色变化转折点即可;

    (3)放置5min后，在上述各管内分别加入0. 1ml NaCl, 混匀后静置2h;

    (4)观察各管内胶体金的颜色变化。未加蛋白(对照管)及加入蛋白量不足以稳定胶体金的试管呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则保持红色不变。其中含蛋白量最低的试管即含稳定1ml胶体金的必须蛋白量。在此基础上再加10% ~ 20%即为稳定胶体金的蛋白实际用量。

(三)胶体金标记蛋白质

    1.按上述方法确定比例后，计算出待包被的胶体金总量稳定所需蛋白质的总用量。

    2.在磁性搅拌下将上述两种溶液混合;

    3.10min 后加入胶体金稳定剂。常用的有3%聚乙二醇(终浓度为0.05%)或5%BSA (终浓度为1%).

     牛血清白蛋白特别适用于多克隆和单克隆IgG，链霉抗生物素蛋白和金黄色葡萄球菌A蛋白等，用其作为稳定剂制备的金探针应用于包埋前标记定位时，比聚乙二醇效果.好。对于金颗粒直径大于25nm以上者，单独使用BSA作为稳定剂效果不好。聚乙一醇使用前应进行微孔滤膜过滤(0.2μ)。

(四)胶体金标记蛋白质(探针)的纯化

    为除去胶体金探针中未标记的蛋白质、未充分稳定的胶体金及各种可能形成的聚合物，必须对标记后的探针进行纯化。可根据具体情况选用超速离心法或凝胶过滤法进行纯化。

    1.超速离心法    胶体金颗粒直径不同及蛋白质种类不同,所需离心转速及时间也不同。常用的胶体金探针离心纯化所需转速见表3。离心应在4℃下进行。

     SPA胶体金的纯化，可在离心管底部加入3~6ml 5%甘油-0.05%聚乙二醇-0.02 %叠氮钠的混合液垫层后进行离心。

常用胶体金探针离心纯化所用转速
金颗粒直径（nm）	标记蛋白	稳定剂	转速	时间（min）
5	羊IgG	BSA	60000×g	60
	SPA	聚乙二醇	125000×g	45
10	单克隆抗体	BSA	45000×g	30
	SPA	聚乙二醇	50000×g	45
15	链霉亲和素	BSA	12000×g	45
	SPA	聚乙二醇	15000×g	45
20	IgG	BSA	14000×g	60
	SPA	聚乙二醇	12000×g	30

    离心后可见管底部有疏松暗红色的沉淀物。理想的应无团块状致密沉淀。一般可见小片状致密沉淀。如大部分均呈团块状致密沉淀,则不宜再使。除疏松红色沉淀物外。致密沉淀物和含有游离蛋白的上清液均无用。操作时先小心地吸取上清液弃去，可剩余少量液体(约5%),再加入相应含稳定剂的缓冲液，重新将沉淀物悬起，再离心1~2次。最后剩余0.5ml上清将疏松红色沉淀物溶解，即为初步提纯的免疫胶体金探针。如进一步应用10%~30%蔗糖或甘油作密度梯度离心，则可得到更为纯化、颗粒均一的免疫胶体金探针。

    2.凝胶过滤法    此法经济简便，制备后的金颗粒不易凝集。选用此法纯化必须以BSA作为稳定剂。

    (1)将胶体金标记物装入透析袋内，置硅胶中浓缩至原体积的1/10左右。

     2) 1500r/min 离心15mnin,吸取上清液加至丙烯葡聚糖S-400层析柱上分离纯化(柱床高20cm，直径0.8cm，以相应缓冲液平衡，加样体积为柱床体积的1/10)。

    (3)胶体金标记IgG者，以0.2molTBSpH8.2(内含0.1%BSA和0.05%迭氮钠)进行洗脱;胶体金标记SPA者，以pH7.4的上述缓冲液洗脱，流速为8ml/h。

    (4)按颜色深浅分管收集洗脱液。先行滤出的液体一般呈微黄色或略浊，为大颗粒聚合物等杂质;纯化的金标记蛋白滤出时呈红色透明，随浓度增高而加深，而后是略呈微黄色的未标记蛋白组分。

(五)胶体金标记蛋白的贮存

     纯化好的胶体金应调整到适宜浓度。分光光度计测定波长520nm时OD值2.5~10为常用浓度上。一般将探针贮于4℃~8℃ (含0.02%~0.05%迭氮钠)，亦可加入50%甘油冻存10。也有将少量探针(25pl)在液氮中迅速冷冻，然后存于-70℃。虽有将少量探针冻于贮存的报道，但这种贮存方法有可能导致胶体金凝集。

相关服务