文章的背景来源于以客户定制的单抗剩余5只小鼠，全部取血，使用ProteinA的方法纯化获得抗体，根据客户要求对纯化后抗体进行浓度和纯度鉴定。下面介绍抗体纯化所需要的仪器耗材以及实验流程。

1.抗体纯化所需的试剂与耗材

材料
Balb/c小鼠（扬州大学比较医学中心）	抗原：亚单位疫苗蛋白（客户提供）
弗氏佐剂（Sigma）	二抗：羊抗鼠-HRP（南京钟鼎生物）
ProteinA胶（南京钟鼎生物）	Acr、Bis、Tris（Sigma）
SDS(Amresco)	TEMED(BIO-RAD)
0.22 μm无菌滤器和透析袋(Millipore)	其它试剂均为国产分析纯

2.抗体纯化所需的仪器

仪器
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机 (美国BECKMAN)	台式高速离心机(德国SORVAL)
320-S pH计(美国Mettler Toledo)	AR5120电子天平(美国AHOΜS)
MultiTemp III 恒温水浴锅 (美国Amersham Pharmacia)	雪花状制冰机(日本SANYO)
酶标仪、洗板仪（Thermo）	超净工作台(中国苏净集团)

3.实验方法及结果

3.1.抗体纯化

将Protein A 琼脂糖凝胶介质装入亲和纯化层析柱，将剩余的5只小鼠抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4度透析过夜，隔日进行纯度，浓度测定。

3.2.抗体鉴定

通过ELISA检测纯化抗体的效价，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对所得抗体进行浓度测定；通过SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察纯化抗体的纯度。

3.2.1.纯化抗体间接ELISA效价检测

具体操作如下：

（1）根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记。

（2）用PBS包被液将亚单位疫苗蛋白抗原稀释成需要的浓度，混匀后加入板条中，每孔100 ul，4℃冰箱过夜。
包被抗原：亚单位疫苗蛋白
包被浓度：5 μg/ml，100 μl / 孔
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液 (PBS，pH 7.4)

（3）包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200 μl封闭液，37℃恒温箱1 h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。

（4）纯化抗体按1/500，2倍稀释，每孔100 μl，37℃恒温箱1 h。

（5）取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100 μl稀释好的酶标二抗，酶标二抗： 山羊抗鼠-HRP，1/5000。37℃恒温箱1 h。

（6）取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100 μl TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37 ℃，15 min。

（7）每孔加入100 μl 1 M HCl溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450 nm读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。

具体结果如下：
包被抗原：亚单位疫苗蛋白
包被浓度：5 μg/ml，100 μl / 孔
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液 (PBS，pH 7.4)
二抗：山羊抗兔-HRP，1/5000

3.2.2.抗体浓度、体积

抗体浓度: 0.45 mg/ml 体积：3.0 ml
缓冲液:磷酸盐缓冲液 (PBS， pH 7.4)

3.2.3.抗体纯度鉴定

纯化后抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色.可见抗体纯化后纯度在85%以上。

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