杂交瘤细胞及其制备

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杂交瘤技术的出现

杂交瘤技术诞生于1975年,当时是由科勒(Kohler)和米尔斯廷(Milstein)建立了淋巴细胞杂交瘤技术,让单克隆抗体制备不再是难题。杂交瘤技术是基于免疫学的理论和技术两方面发展产生的,除此之外,抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等,也为杂交瘤技术提供了技术上的指导。

确定杂交瘤细胞的正确性

杂交瘤细胞的亲本细胞来自骨髓瘤细胞(SP2/0)和免疫亲代细胞(常用的是脾淋巴细胞)。其中骨髓瘤细胞的一些相关要求是应为不合成或不分泌免疫球蛋白链型,应具有符合骨髓瘤细胞的染色体特征,并有明确的背景来源及符合要求的保存条件。免疫亲代细胞来自经抗原免疫的鼠脾B淋巴细胞或外周血B淋巴细胞。

在实验过程中该如何确定杂交瘤细胞的正确性呢?可以从以下两个方面考虑:一是看其分泌抗体的稳定性,也就是说若其连续克隆化后抗体阳性率仍可达100%,且经体外连续传代3个月以上和反复冻存、复苏,细胞系能保持稳定分泌特异性抗体。而是观察它的细胞特征,显微镜下检查细胞分裂中期的染色体情况,若符合杂交瘤细胞特征的就是正确的。

杂交瘤细胞的制备

1. 骨髓瘤细胞的准备

选择大小均一,浑圆透亮,边缘清晰,排列整齐,呈半致密分布的生长状态良好的细胞。之后弃上清,以不完全培养基洗涤一次后,用10mL不完全培养基将骨髓瘤细胞轻轻吹下。

2. 脾淋巴细胞的准备

a、取加强免疫后3天的小鼠,摘除眼球后采血供分离阳性血清。
b、使其颈脱位将小鼠致死,之后用75%酒精消毒体表5min,随即放入超净台内小鼠解剖板上,左侧卧位,用7号针头固定四肢。
c、无菌打开腹腔取出脾脏,用基础培养基洗涤,洗涤的同时仔细去掉周围附着的结缔组织。
d、随后将脾脏转移至盛有DMEM的另一个平皿中。以弯头针头压住脾脏,用小针头在脾脏上插孔,并用镊子挤压,使脾细胞充分释放,制成脾细胞悬液。

3. 饲养细胞的制备

取一只健康的ICR小鼠,摘眼球采血,颈脱臼处死,体表消毒和固定后,从大腿上剪开皮肤,暴露腹膜,酒精棉球消毒腹膜。用10mL注射器,12号针头,注射5-10mL HAT培养基到腹腔,右手固定注射器,左手持酒精棉球轻轻按摩腹部,抽回腹腔内液体,注入已准备好的容器中。

4. 细胞融合

a、将上述制备的骨髓瘤细胞与脾淋巴细胞混于一支50mL带盖的离心管中,1000rpm离心10min,注意上清要充分吸净,以免影响PEG的作用。
b、将离心管置于手掌中,轻轻振荡底部,务必使两种细胞充分混匀。
c、用1mL吸管将预热的PEG在45~60s内缓慢加入融合管中,注意一定要边加边轻轻摇匀。
d、之后立即滴加37℃预热的DMEM,使PEG稀释而失去作用,具体的加法是用吸管在第一分钟内加1mL预热的不完全培养基,第二分钟内加2mL,第三分钟加8mL(注意加的速度按照先慢后快原则),37℃静置10min,1000rpm离心10min,弃上清。
e、加入5mL的HAT培养基,轻轻悬浮沉淀细胞,再加入适量的腹腔巨噬细胞,最后补加HAT至50mL左右。
f、分装于96孔细胞培养板,然后将培养板置于37℃,5% CO2培养箱内培养。
g、5天后用HAT培养基换出一半培养基。
h、观察杂交瘤细胞的生长情况,待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时,吸取适量细胞上清进行抗体检测。
i、经 HAT 选择培养基培养至10-14天,未经融合的骨髓瘤细胞会相继死去,而杂交瘤细胞则会逐渐长成细胞集落。之后停用HAT液,改用HT培养基。当细胞集落面积超过培养孔的 1/10以上时,之后可用相应的敏感免疫学方法检测阳性孔。若连续三次检测结果均是逐渐升高或维持在同一水平,之后便可以做克隆化,剩余部分则可以冷藏起来做长期保种用。

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