单克隆抗体制备实验常见问题解析

1.克隆原来是阳性的，为什么后来转为阴性了？

答：首先要注意，正常情况下，杂交瘤也不是绝对稳定的，确实容易发生染色体丢失的情况，尤其是当细胞移到新环境中生长，如从小孔扩大到大孔，或者复苏操作时，更容易发生阳性变为阴性。但是也有一些办法尽量减少阳性变为阴性的办法。一般可以从这几个方面加以注意：
（1）永远保证细胞处在最佳的生长环境中。尤其是培养基不能长期不换，一般来说，当细胞增长到一定密度的时候，培养基就开始变颜色，这个时候就要准备换培养基了，除了换培养基，同时应该控制好细胞的密度，可以弃掉过多的细胞，使新加入的培养基不至于很快被消耗。
（2）对于重要的细胞株，每一步都把阳性的细胞保种。
（3）不要过于频繁操作细胞，当细胞生长密度不是很大的时候，不要频繁操作，否则细胞容易出现死亡或者生长形态发生明显变化。
（4）对于传代次数较多的细胞株需要经常进行亚克隆，并将每一次的亚克隆株冻存保种。
（5）当细胞被支原体等微生物污染，也会发生由阳性转为阴性的情况。

2.杂交瘤细胞融合后却得不到阳性克隆的原因？

答：这是单克隆抗体制备实验中最让人头疼的问题，可能的原因有：
（1）动物未免疫成功就进行了融合。
（2）融合后得到的克隆较少，故得到阳性克隆的机率也较小。
（3）筛选克隆手段不正确。例如有些小分子物质不可以直接包被到酶标板上，再如使用了不适当的二抗等诸多因素，也有人直接不使用ELISA作为筛选方法的，成功率也有待确定。
（4）抗原成份与细胞培养条件中的物质相同或类似，或者与筛选过程中有同抗原结构相同或类似的物质产生了竞争反应。例如，如果需要制备抗BSA的单抗，则进行ELISA筛选检测时，不可使用含BSA的样品稀释液进行封闭或稀释二抗操作，否则牛血清中的BSA直接与抗体相结合，最后做ELISA筛选的时候无法得到阳性结果。解决的办法只有使用其它的动物的血清或者使用无血清培养基。再如，如果需要制备酪蛋白的单抗，则做ELISA筛选时，二抗的稀释液不可以使用脱脂奶粉。
（5）其它所有能影响ELISA等相关筛选手段的因素。

3.为什么我的杂交瘤细胞不能制备腹水或者制备的腹水中没有抗体或腹水没有效价？

答： 不能制备腹水的原因大部分是人为原因：
（1）致敏不正确，例如使用了不正确的致敏剂，或者致敏时间与接种杂交瘤的时间相差太久。
（2）杂交瘤的接种位置不正确，没有打到腹腔，而是打到了皮下。
（3）接种的杂交瘤细胞数量太少或者细胞状态不好。一般不应少于10万个细胞，建议在100万个细胞左右为宜。
（4）制备腹水小鼠的种系与参与融合的细胞来源的动物种系相差太远，以至制备腹水的小鼠对杂交瘤有强大的免疫反应并将其杀死，建议更换小鼠品系重新接种。

对于腹水没有效价，可能的原因：
（1）制备腹水的杂交瘤极不稳定，打到小鼠身上之前就失去抗体分泌能力或者打到腹腔内就失去了分泌能力。
（2）致敏小鼠时采用了错误的致敏剂，如使用了弗氏完全佐剂，这时即使不打杂交瘤，小鼠也会产生腹水。
（3)极其罕见的情况，就是此杂交瘤生产的抗体可以与小鼠体内的分子相互作用，于是杂交瘤产生的抗体被小鼠的相关蛋白中和，这种情况下，小鼠的身体可能会出现明显的异常。
（4）检测腹水效价的实验方案有问题，或者腹水稀释比过大。

4.免疫后效价低甚至没有效价的原因，该如何解决？

答：可以从以下几个方向思考：
（1）设计的抗原与被免疫的动物内源蛋白有极高的同源性或者抗原是免疫原性极差的小分子物质。对于前一种情况应该重新设计抗原，设计抗原时尽量选取目标蛋白特异性的序列，可以设计为短肽然后再与载体蛋白偶联之后免疫；对于后一种情况，首先确认小分子物质是否已经正确地和载体蛋白偶联，如果偶联没有问题，可以更换其它的载体蛋白，一般来说把BSA偶联小分子做为免疫原，偶联OVA作为检查原。
（2）免疫的周期不正确。免疫周期过长或过短，各免疫步骤之间的间隔过长或过短都有可能影响免疫效果。免疫间隔一般是2～3周。
（3）免疫佐剂不合适。TiterMax等佐剂在免疫时，对于某些抗原可能效果不佳，弗氏佐剂也不能保证完全有效，此时可以考虑更换佐剂尝试。
（4）免疫剂量不合理。过大的免疫剂量可能导致免疫耐受，过少的免疫剂量可能无法激活免疫应答。一般来说，实际免疫剂量与标准所用剂量不要相差两倍以上。
（5）免疫途径不合理。对于有些免疫原性弱的抗原，可以考虑脾内免疫方法。
（6）检测效价的过程存在错误操作，尤其考虑包被是否成功或二抗使用是否正确。同时，一抗（即血清）稀释梯度尽量放宽，一般建议从1：500或1：1000开始作梯度稀释。对于小分子物质，效价达到1：2000仍可视为免疫成功。

5.为何融合后细胞出现不生长的情况或者融合后克隆很少？

答：这个问题是要我们在单克隆抗体制备实验中要注意的问题，可能是以下几个方面原因导致，可以一一排查。
（1）免疫用的动物品系不正确或者品系不纯。免疫用的动物一般应该与骨髓瘤来源的动物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤细胞时应该选用Balb/C小鼠，同时必须使用品系纯正的小鼠。
（2）培养基中加入了过高浓度的HAT，或者仅A的浓度过高或HT的浓度过低，建议用纯的骨髓瘤和已有的杂交瘤作HAT浓度筛选。
（3）培养基不正确或血清浓度不正确或使用了劣质血清。
（4）未正确制备饲养层细胞。参见本站有关饲养层细胞制备的部份。
（5）接种杂交瘤细胞的培养板过多。一般在5-20块96孔板为宜。
（6）融合后，未及时转移或稀释细胞。有人在做融合后喜欢把融合的细胞先放在培养瓶中培养，然后再滴到96孔板上。如果在培养瓶中培养的时间过长，也可能出现克隆利率少的情况。
（7）细胞被污染。在显微镜下仔细观察是否有明显的微生物污染。即使看不到有明显的微生物，也应该考虑是否有支原体污染，有条件的可以做支原体检测。
（8）细胞培养条件不正确，确保细胞培养在恒定的37度较湿的环境，同时保证CO2浓度在4-5%左右。

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