本文依据实际交付的抗体修饰案例，介绍了生物素（Biotin）标记抗体的实验过程，包括实验所需要的实验材料以及具体的实验步骤。

概述

    以客户提供a蛋白10 mg，进行生物素标记实验，对标记后蛋白进行BCA蛋白浓度检测、SDS-PAGE纯度鉴定，并将客户提供猴多抗做为检测原，对a-Biotin进行间接ELISA效价检测。

1.试剂和耗材

试剂和耗材
生物素（购自Thermo）	a蛋白（客户提供）
猴多抗（客户提供）	SA-HRP（南京钟鼎生物）
SDS(Amresco)	BCA蛋白定量试剂盒（南京钟鼎生物）
铝箔纸	其它试剂均为国产分析纯

2.主要实验仪器

主要实验仪器
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机（美国BECKMAN公司）	台式高速离心机（德国SORVAL公司）
320-S pH计（美国Mettler Toledo公司）	MultiTemp III 恒温水浴锅（美国Amersham Pharmacia公司）
超净工作台（中国苏净集团）	AR5120电子天平（美国AHOΜS公司）
10 μL移液器（Eppendorf公司）	1 mL移液器（Eppendorf公司）

3.生物素标记抗体实验方法及结果

3.1.a蛋白生物素标记

（1）根据Thermo的说明书，将所用试剂及a蛋白恢复至室温，称取一定量的生物素，每1.0 mg生物素用180 μL的无菌纯水溶解成5.5 mg/mL的溶剂。

（2）将生物素135 μL缓慢加入到10 mg a蛋白溶液中。

（3）室温下避光旋转反应1 h。

（4）反应结束后，用1×PBS透析过夜，次日，换液继续透析5 h。

（5）透析结束后，收集并分装，-80°C避光保存。

3.2.a-Biotin BCA蛋白浓度检测

（1）将BCA蛋白定量试剂盒、a-Biotin及所需试剂，平衡至室温。将Solution A摇晃混匀，根据样品数量，按50体积Solution A加1体积Solution B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。

（2）用标准品稀释液将标准蛋白（0.5 mg/mL BSA）按所需梯度稀释加入到96孔板中，总体积为20 μL。

（3）加适当体积待测样品到96孔板的样品中，加标准品稀释液补足至20 μL。

（4）各孔加入200 μL BCA工作液，用加样枪轻轻吹打混匀，37℃放置30 min。

（5）冷却至室温后，用酶标仪测定A562。

（6）根据标准曲线计算出样品中蛋白浓度。

具体结果略。

3.3.SDS-PAGE纯度鉴定

标记后蛋白进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。

3.4.间接ELISA效价检测

（1）根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记。

（2）用PBS包被液将猴多抗稀释成需要的浓度，混匀后加入板条中，每孔100 μL，4℃冰箱过夜。
包被抗原： 猴多抗
包被浓度： 1 μg/mL，100 μL/孔
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液 (PBS，pH7.4)

（3）包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200 μL封闭液，37℃恒温箱1 h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。

（4）a-Biotin按1/5000起始，3倍稀释，每孔100 μL，37℃恒温箱1 h。

（5）取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100 μL稀释好的酶标二抗，酶标二抗：SA-HRP，1:10000。37℃恒温箱1 h。

（6）取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100 μL TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37 ℃，15 min。

（7） 每孔加入100 μL 1 M HCl溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450 nm读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。

具体结果如下
包被抗原： 猴多抗
包被浓度：1 μg/mL，100 μL/孔
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液 (PBS，pH7.4)
二抗：SA-HRP，1:10,000

3.4.结果分析

通过BCA蛋白浓度检测结果得出，a-Biotin浓度为2.5 mg/mL；通过间接ELISA效价检测得出，a-Biotin标记物针对猴多抗效价在10935K左右。

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