本文依据实际交付的抗体修饰案例,介绍了生物素(Biotin)标记抗体的实验过程,包括实验所需要的实验材料以及具体的实验步骤。
概述
以客户提供a蛋白10 mg,进行生物素标记实验,对标记后蛋白进行BCA蛋白浓度检测、SDS-PAGE纯度鉴定,并将客户提供猴多抗做为检测原,对a-Biotin进行间接ELISA效价检测。
1.试剂和耗材
试剂和耗材 | |
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生物素(购自Thermo) | a蛋白(客户提供) |
猴多抗(客户提供) | SA-HRP(南京钟鼎生物) |
SDS(Amresco) | BCA蛋白定量试剂盒(南京钟鼎生物) |
铝箔纸 | 其它试剂均为国产分析纯 |
2.主要实验仪器
主要实验仪器 | |
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Allegra 21R 台式高速冷冻离心机(美国BECKMAN公司) | 台式高速离心机(德国SORVAL公司) |
320-S pH计(美国Mettler Toledo公司) | MultiTemp III 恒温水浴锅(美国Amersham Pharmacia公司) |
超净工作台(中国苏净集团) | AR5120电子天平(美国AHOΜS公司) |
10 μL移液器(Eppendorf公司) | 1 mL移液器(Eppendorf公司) |
3.生物素标记抗体实验方法及结果
3.1.a蛋白生物素标记
(1)根据Thermo的说明书,将所用试剂及a蛋白恢复至室温,称取一定量的生物素,每1.0 mg生物素用180 μL的无菌纯水溶解成5.5 mg/mL的溶剂。
(2)将生物素135 μL缓慢加入到10 mg a蛋白溶液中。
(3)室温下避光旋转反应1 h。
(4)反应结束后,用1×PBS透析过夜,次日,换液继续透析5 h。
(5)透析结束后,收集并分装,-80°C避光保存。
3.2.a-Biotin BCA蛋白浓度检测
(1)将BCA蛋白定量试剂盒、a-Biotin及所需试剂,平衡至室温。将Solution A摇晃混匀,根据样品数量,按50体积Solution A加1体积Solution B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀。
(2)用标准品稀释液将标准蛋白(0.5 mg/mL BSA)按所需梯度稀释加入到96孔板中,总体积为20 μL。
(3)加适当体积待测样品到96孔板的样品中,加标准品稀释液补足至20 μL。
(4)各孔加入200 μL BCA工作液,用加样枪轻轻吹打混匀,37℃放置30 min。
(5)冷却至室温后,用酶标仪测定A562。
(6)根据标准曲线计算出样品中蛋白浓度。
具体结果略。
3.3.SDS-PAGE纯度鉴定
标记后蛋白进行SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色。
3.4.间接ELISA效价检测
(1)根据实验需要设计好包被板,并在板条上做上标记。
(2)用PBS包被液将猴多抗稀释成需要的浓度,混匀后加入板条中,每孔100 μL,4℃冰箱过夜。
包被抗原: 猴多抗
包被浓度: 1 μg/mL,100 μL/孔
包被缓冲液:磷酸盐缓冲液 (PBS,pH7.4)
(3)包被好后,弃去包被液,洗板3次,每孔加入200 μL封闭液,37℃恒温箱1 h。取出酶标板,弃去内液,洗板1次。
(4)a-Biotin按1/5000起始,3倍稀释,每孔100 μL,37℃恒温箱1 h。
(5)取出酶标板,弃去内液,洗板3次,向每孔中加入100 μL稀释好的酶标二抗,酶标二抗:SA-HRP,1:10000。37℃恒温箱1 h。
(6)取出酶标板,弃去内液,洗板4次,每孔先加入100 μL TMB显色液,根据颜色的深浅决定显色时间,一般37 ℃,15 min。
(7) 每孔加入100 μL 1 M HCl溶液,终止反应。即刻在酶标仪上450 nm读数,将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度,定为该样品的效价。
具体结果如下
包被抗原: 猴多抗
包被浓度:1 μg/mL,100 μL/孔
包被缓冲液:磷酸盐缓冲液 (PBS,pH7.4)
二抗:SA-HRP,1:10,000
3.4.结果分析
通过BCA蛋白浓度检测结果得出,a-Biotin浓度为2.5 mg/mL;通过间接ELISA效价检测得出,a-Biotin标记物针对猴多抗效价在10935K左右。
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