酶标记抗体

抗体可以共价偶联酶标记。理想的偶联反应结果是1:1的抗体与酶比率，而且没有特异活性和酶配体的损失,但这一点到目前尚不能达到。然而由于酶作用的信号内在扩增，却使很差的连接也能显得相当的敏感。可达pmol(10^-6mol)的检测不平,最近随着研究的发展,灵敏性已达到每毫升检测出几千个分子的水平。

已有许多种酶被用于抗体的标记，其中应用最广泛的为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β一半乳糖苷酶,有时也用尿素酶和葡萄糖氧化酶。理想的标记用酶应具有便宜、稳定、分子小及易于标记等特点，同时还应具有高度的催化活性和具有产物为可溶性(液相酶免疫分析法)和不可溶性(固相免疫法)的底物范围。表9.3列出几种常用酶的优缺点与适用范围。

酶的选择

酶的选择
酶	优点	缺点	检测方法	应用
辣根过氧化物酶	底物适于免疫组化,1:1偶联	血细胞内内源酶水平高，可溶性底物的灵敏性低	可溶性一TMB	免疫分析法
			不溶性一氯萘酚DAB/钴	免疫组化、免疫印迹
碱性磷酸酶	可溶性底物良好,适于免疫印迹,有超敏感性底物	一些组织有内源性酶，连接的分子大	可溶一PNPP	免疫分析法
			不溶性一BCIP/NBT	免疫印迹
β一半乳糖苷酶	内源性酶活性低,底物好	易失活,连接的分子大	可溶性一ONPG	免疫分析法
			不溶性一BCIG	免疫印迹、血液样品的免疫细胞化学

一般情况下,购买酶联试剂更为方便,但对于单克隆抗体或亲和层析纯化抗体,这类试剂需自行制备。

一、辣根过氧化物酶偶联抗体——了解详情

二、碱性磷酸酶标记抗体

用戊二醛法简单的一步处理即可获得满意的抗体一碱性磷酸酶结合物。除这种结合物的分子和异源性大以外，所得的结合物仍保持良好的免疫学和酶学活性。主要的缺陷是使用的酶价高而且所用的抗体和酶都要求高浓度。

1.将10mg抗体和5mg碱性磷酸酶混合至终体积1ml。碱性磷酸酶通常在65%饱和硫酸铵中，使用前需4000g离心30分钟，然后用抗体溶液悬浮沉淀。

2.混合物用0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.8)透析过夜,中间换缓冲液4次。这对去除硫酸铵沉淀的游离氨是必需的。

3.将酶一抗体混合物转入一适于小体积搅拌的容器中，在通风橱内将小磁棒放入容器轻轻搅拌并加入0.05ml 1%的EM级(电泳纯)戊二醛。

4.5分钟后停止搅拌。

5.置室温3小时后加入0.1ml 1M的乙醇胺（pH7.0）。

6.继续置温2小时后,PBS透折过夜，中间换PBS三次。

7.混合物以40 000g离心20分钟。

8.在4℃将上清保存在有50%甘油，1mM ZnCl₂ 1mM MgCl₂,0.02%叠氮钠的溶液中。

三、β一半乳糖苷酶偶联抗体

使用β一半乳糖苷酶的优越之一是在于人们先前对该酶有大量研究和它的高活性。抗体可用简单的戊二醛一步法或马来酰亚胺甲酰一n——羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)偶联抗体。戊二醛法应用更为普遍，但MBS法偶联也有许多优点。

1.戊二醛偶联法

抗体——酶结合物易形成大分子，但可以用离心的方法去除超大分子后,抗体一酶结合物还是可以用于大多数实验目的。

①取10mg抗体和5mg β半乳糖苷酶溶于PBS中，至终体积2ml。

②混合物用0.1M磷酸盐缓冲液透析,中间换液4次,过夜。这是去除游离氨基团所必须的。

③将酶一抗体混合物转入一适合小体积搅拌的容器中，在通风橱内将小磁棒放入容器中,缓慢搅拌，加入0. 1ml 1%的EM级戊二醛。

④搅拌5分钟。

⑤置室温3小时后,加入0. 1ml 1M乙醇胺(pH7.0)。

⑥室温继续放置2小时后,4℃PBS透析过夜，中间换三次PBS。

⑦混合物以40 000g离心20分钟。

⑧上清即抗体一酶结合物，4℃保存在50%甘油一0.02%叠氮钠溶液中。

2. MBS偶联法

MBS为是源双功能试剂，可以将有半就氨酸的蛋白同有游离氨基的蛋白联结。由于抗体正常情况下无半既复，MBS首先通过游离氨基同抗体结合，用透析法去除过度的交叉结合体后,将抗体一MBS 加到β半乳糖苷酶上。

①用50mM NaCl、100mM 磷酸钠(pH7.0)缓冲液配制1mg/ml的抗体浓度。

②用二氧杂环乙烷(dioxane)配制20mg/ml MBS,加入1μl MBS溶液到1ml抗体溶液中。混匀。

③30°C孵育1小时。

④用含10mM MgCl₂,50mM NaCl 的10mM磷酸钠(pH7.0)透析,几小时换一次液，反复数次。

⑤用10mm磷酸钠配制β半乳糖苷酶至终浓度1.5mg/ml。每mg起始抗体加入1ml酶液。

⑥30℃孵育1小时。

⑦加入二巯基乙醇至终浓度10mM。

抗体结合物可用蛋白A珠层株或DEAE离子交换法与β-半乳糖苷酶分开。

相关服务