细胞大规模培养技术

　　目前，多种表达系统均可实现重组抗体的异源表达，但是抗体药物的产业化制备，始终以动物细胞大规模培养工艺为主。1986 年首个治疗性抗体 OKT3TM上市之初，动物细胞表达水平普遍不足 100mg /L。经过近三十年间发展，业内用于重组抗体生产的动物细胞培养工艺，无论细胞培养密度，还是抗体表达水平均提高五十倍以上。行业技术水平的飞速提升，既源于上游细胞系构建技术的突破，也得益于细胞大规模培养工艺的日臻成熟。尤其是后者综合培养基开发，工艺优化，结合新型生物反应器的使用，实现了动物细胞的高密度、高表达培养，满足了临床上对于抗体药物“公斤级”产能的需求。

1、动物细胞培养的过程参数与培养模式

　　动物细胞的体外培养，涉及生物反应器的物理参数( 温度，pH，DO，DCO2 等) 、培养基的营养成分( 葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸、维生素等) 的消耗，以及自身代谢产物( 乳酸、氨、重组蛋白等) 的积累与生理生化参数 ( 细胞密度、活性、能荷等) 的变化。作为重组抗体生产的“细胞工厂”，上述过程参数的改变会直接影响生产细胞系的活性与重组抗体的收率。

1． 1 流加培养方式及优化策略

　　目前上市的重组抗体中绝大多数是采用流加培养工艺生产，这主要由于与之配套的生物反应器( 搅拌罐、气升罐等) 制造成熟，可线形放大( 最大至20000L) ，操作简单等原因。但是，流加培养过程中会出现营养物质消耗、代谢废物积累，以及产品质量不稳定等问题。因此，流加培养工艺的优化主要集中在基础培养基、流加培养基以及流加策略上，其优化的原则是根据细胞的代谢特点设计补料培养基，用于补充易耗成分，降低副产物积累。

1． 2 灌注培养方式及优化策略

　　灌注培养模式下，反应器几乎可实现“恒化器”培养效果，细胞密度、蛋白产量可较流加模式。但是灌注培养细胞截留需特殊装置，提高数倍工艺放大存在难度，其产业化应用的经济性尚存争议。目前，只有少数抗体及易降解的重组蛋白( 凝血因子) 等使用该工艺。灌注培养工艺优化，主要集中在灌注培养基及灌流速度上。其优化原则是通过降低灌流速度，提高培养基的利用率和产物的容积产率。
　　此外，控制流加灌注工艺同时具有流加工艺和灌注工艺的优点。该工艺对易产生代谢废物的营养进行限制性流加。根据细胞摄氧量的变化，流加氨基酸以满足高密度细胞的营养需求。

2、用于提高重组抗体表达水平的方法

　　动物细胞的高密度培养，有赖于合适的培养基以及适宜的反应器环境。因此，旨在提高重组抗体表达的工艺开发，主要集中在“个性化培养基”的开发以及过程参数的优化上。上述研究通常需要借助小型化反应器，如传统的三角瓶、孔板，转管等。近年，新型自动化小规模反应器等不断出现，此类装备不仅能模拟反应器的pH、DO、培养基流加等控制条件，而且能够实现试验条件的通量筛选，大大加速了细胞培养工艺开发的进程。

3、细胞培养工艺对重组抗体质量的影响

　　作为生物大分子的重组抗体，同时具备聚体、降解、糖基化修饰、氧化、脱酰基化、异构体、二硫键错配等多种变异形式。由“细胞工厂”异源表达的重组。

3．1 聚体与降解

　　抗体分子可形成共价、非共价，可溶、不可溶等多种形式的聚体。聚体形式的蛋白药物会引起临床上的免疫原性。在动物细胞生产抗体的工艺中，聚体含量最高可达 30% 。影响聚体形成的原因有物理参数( 温度、pH，DO 等) 、培养基成分( 如 Cu2 + 、谷胱甘肽、胱氨酸、半胱氨酸等) 等因素。通常通过提高生产期温度和提高培养基中胱氨酸含量，改变 pH 和渗透等方法，减少细胞培养过程中聚压、添加地塞米松体的生成。抗体四聚体的结构有赖于二硫键的正确组装。
　　细胞培养过程中二硫键的还原会直接造成抗体的降解。此外细胞裂解后释放出的硫氧还蛋白或其他二硫键还原酶、组织纤维酶，也可造成重组抗体的错配、抗体融合蛋白的降解。可以通过细胞收液中添加硫酸铜、胱氨酸，或优化 pH 的方法避免降解; 此外，通过优化培养基中半胱氨酸浓度避免抗体内部三硫键的生产。

3.2 糖基化修饰

　　IgG 在其保守位点 ASN297 可形成的 N 端糖基化修饰。糖基化修饰程度对抗体药物的药效学 ( ADCD、 CDC 及抗炎活性等) 和药代学( 半衰期) 都会造成显著的影响。已经证明已上市的多个抗体，其糖基化修饰程度并不均一，这很大程度与其制备工艺中细胞培养环节有关。研究发现: 宿主细胞、培养参数 ( DO、温度、pH、pCO2 ) 、操作模式( 灌注、流加) 甚至搅拌转速，均会对抗体的糖基化程度造成影响。

3．3 电荷变异与氨基酸变异

　　多种化学修饰都会引起重组抗体等电点的改变，如: 脱酰胺化、唾液酸化、重链 C 段赖氨酸清除会造成重组抗体的带正电荷; 赖氨酸 / 甘氨酸酰胺化反应、甲硫氨酸氧化作用等会造成重组抗体带负电荷。提高培养基中 Cu2+ 浓度，降低 Zn2+ 浓度，可以增强重组抗体 C 端脯氨酸的酰胺化，最终导致重组抗体发生碱性电荷变异。
　　此外，重组抗体的异源合成中易发生某些氨基酸变异，如 Ser 被 Asn 随机替代。可以通过降低培养基中Asn 含量 ，或提高含量 Ser来减少此种变异发生频率。

4、产业化阶段中细胞培养工艺的建立

　　抗体药物的不同研发阶段，对工艺开发的要求不尽相同。处于临床前研究阶段，生产工艺仅需满足制备样品。进入临床研究后，随着抗体蛋白的需求增加，培养工艺面临着工艺放大与技术转移。而抗体药物进入到临床三期研究阶段后，具备上市生产销售的可能，生产企业则需确定生产工艺，并对该工艺进行充分的定性研究、认证工作。

5、结语

　　随着组学技术的发展与应用，目前的细胞培养工艺开发，已经从简单的工艺参数优化，进入系统的组学研究深度，生产细胞的代谢网络与重组抗体合成机制日益清晰。对于生产细胞系在不同工艺条件下抗体产量的差异，已经能够从基因组、蛋白组、代谢组等不同层次进行分析、解释 。这就为今后大规模细胞培养工艺开发提供了新的线索。
　　同时，业内随着“QbD”理念的深入，越来越多的“过程分析技术 ”开始应用于细胞培养过程，旨在通过加强关键过程参数的监控来确保蛋白药物的最终质量。如: 培养基检测、培养过程监控、多批次数据分析等。未来基于重组抗体表达的细胞大规模培养工艺开发，将朝着稳定产能，提高质量的方向发展。

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