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本文介绍了ADA单克隆抗体制备的方案,分两个步骤,分别是第一阶段的动物免疫与筛选方法的建立与验证,以及第二阶段的ADA杂交瘤细胞制备。
阶段一(M1):动物免疫与筛选方法的建立与验证
1、目标:
完成动物免疫;建立可行的筛选方法;完成鼠血清效价评估,做出GO/NO-go决定。
2、材料准备:
由钟鼎生物进行酶切纯化制备 F(ab’)2
3、内容:
动物免疫:10只Balb/c小鼠, 10只SJL小鼠,6只SD大鼠分别免疫4次
ELISA测定血清效价评估:
免疫后血清效价间接ELISA检测。
4、周期:2-3个月
5、交付内容:M1阶段性报告包含免疫流程、血清效价检测数据。
阶段二(M2): ADA杂交瘤细胞制备
1、目标:通过细胞融合及筛选ADA杂交瘤细胞。
2、客户提供:同型对照IgG
3、内容:
(1)利用电融合技术将动物脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合并铺20-30块96孔培养板(融合2次);
(2)间接ELISA筛选与F(ab’)2强阳性与同型对照抗体IgG不反应的细胞克隆;
(3)扩增、复制所有阳性克隆,收集阳性上清提供给客户检测;
(4)根据中结果确定阳性细胞株并通过有限稀释法进行单克隆化;
(5)获得20-30株阳性单克隆细胞株,提供上清给客户进行测试;
(6)根据结果最终确定所需细胞株2-5株,扩增、冻存;
(7)选择1-2株细胞株进行无血清扩增培养,收集细胞上清,利用蛋白A纯化柱获得纯化抗体。
技术要求:抗体纯度>95%;抗体效价>10万倍稀释度;特异性识别CDR区;与亲本同型对照IgG交叉反应<2%。
5、时程:3-4月。
6、交付内容
M2报告;
纯化单克隆抗体;
抗体发货COA文件。
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