杂交瘤细胞制备方法-杂交瘤细胞-钟鼎生物

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杂交瘤细胞制备方法

实验器材：

水浴设置为39-40ºC
96孔细胞培养板，所有外孔充满PBS（通常约6个）
50毫升聚丙烯离心管
4对灭过菌的精细镊子
2对灭过菌的普通细尖镊子
2对灭过菌的细尖的剪刀
一双灭过菌的中点剪刀
25毫升灭过菌的烧杯
灭过菌的巴斯德吸管

实验试剂：

70％ ETOH
PBS
一瓶全营养基
SF介质不含添加剂
50％PEG（Boehringer-Mannheim）
50X HAT
50X HT

实验步骤:1.预热PEG和所有器材至39ºC。
2.在平皿盖中，放置三个无菌的25毫升烧杯，内含10毫升无菌SF培养基（不必加热）。
3.用CO2灌输小鼠，然后使其颈椎脱臼。
4.立即将腹部浸泡在乙醇中。
5.将小鼠放在无菌盖布上。
6.使用无菌的细尖镊子和中剪刀，将皮肤延切割，然后切开两个皮瓣，在切割时将它们拉回，以保持腹部的无菌状态。将仪器浸入乙醇中。以同样的方式切开腹腔壁，切开时将层拉回，以免污染腹部内容物。使用一套新的仪器（精细的）去除脾脏，尽可能多地去除附着的脂肪，并立即放入含有SF培养基的50 ml离心管中。
7.通过心脏穿刺对小鼠进行放血-这种血液将提供在筛选期间用作对照的多克隆血清。
8.把脾脏放至平皿盖上。
9.通过培养基烧杯将脾脏串联。
10.将脾脏置于80mm组织培养皿中。
11.加入~10毫升SF培养基。
12.用精细尖头镊子分开脾脏，然后用5cc注射器柱塞的无菌端挤压。
13.将悬浮液转移到50ml聚丙烯管中，用SF培养基加至50ml，并以400×g沉淀3分钟。
14.取出上清液，加入3毫升冷裂解缓冲液。
15.间歇性涡旋2分钟，在混合之间将细胞保持在冰上。
16.加入15毫升SF培养基。
17．离心3分钟，丢弃上清。
18.沉淀重悬于10毫升SF培养基中，并细胞计数。将细胞保存在水浴中直至使用。
19.收获100毫升NS1细胞沉淀，重悬于10ml SF培养基中并测定细胞数量/活力。
20.将NS1细胞和脾细胞合并在50ml管中，比例为3：5（NS1：脾细胞）（将脾细胞数乘以0.6，以确定添加多少NS1。
21.涡旋 2-3秒。
22.在200xg下离心3分钟，不要倒掉上清。
23.在39℃下，将细胞沉淀10分钟。
24.取出上清液，轻轻松动颗粒。这样细胞不会溅到管子的两侧。
25.在1分钟内缓慢加入1ml温热的PEG，轻轻混合。该步骤应在管子在温水烧杯中保温的同时完成。
26.在1分钟内加入1毫升温热的SF培养基; 在第二分钟加入3毫升; 在第三分钟加入16毫升，用SF培养基加入50毫升。
27.在400 x g离心下5分钟（此步骤实现融合）。
28.小心取出上清液。
29.轻轻加入10ml温热的SF（无重悬）旋转2分钟。
30.取出并轻轻地将细胞重悬于含有FBS的完全NS1培养基中，使得每ml有1×10 6个脾细胞（基于原始脾细胞数）。如果脾细胞计数总计在40-60万之间，则可以使总体积达到50ml。
31.向96孔平底板的孔中加入100ul悬浮液。在37°C和10％CO2下孵育。
32.第二天，每孔加入100μl在NS1培养基中制备的2x HAT。
33.准备好在7-21天后筛查杂交瘤。通常情况下，大多数是10-12天。细胞迅速生长，并且活跃生长的细胞（一旦看到菌落）需要每隔几天添加培养基（用新鲜培养基稀释四倍），细胞不粘附，所以要小心到掉用过的培养基。
34.一旦开始变黄，筛选抗体产生。通常，您可以从96孔板中取出50-100μl培养基。您可以通过ELISA或Western印迹进行筛选。用新鲜的HAT培养基更换培养基。细胞可以容忍微孔中一到两次培养基的变化，但在那之后往往会死亡，所以它们需要循环到更大的（48孔板）孔中。
35. 为了放大，我通常将1毫升放入较大的孔中，然后用移液管轻轻搅动96孔板中的细胞，吸尽尽可能多的液体，并转移到48孔板中。此时，应该命名单元格。默认是使用原始板和井号，有些人喜欢在96孔板上重新填充孔作为保险。
36. 通常需要几天到一周的时间才能使细胞长出下一个大小。随着水孔变黄（或细胞达到汇合），继续按比例放大。每次转移时，将一小部分用过的培养基转移到下一个大小是个好主意，因为它将包含细胞所需的生长因子。
37. 在你准备好12孔板的时候，有足够的细胞可以冷冻，这是一个好主意，即使有可能不稳定的杂交瘤。
38. 杂交瘤通常需要3个月左右才能稳定下来。将细胞保持在HAT培养基中直至它们进入12孔阶段，然后逐渐将培养基换为HT（每个细胞都有自己的时间表和生长方式，通常在进行亚克隆之前需要完成培养基更换）。