实验原理及目的:

染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用最为主要的方法之一。本实验的原理是在活细胞状态下通过化学交联剂将蛋白质一DNA复合物固定，并将其随机打断成一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学的方法沉淀出目的蛋白质一DNA复合体，从而特异性地富集与目的蛋白相结合的DNA片段。通过对目的DNA片断的纯化与检测，最终获得蛋白质与DNA相互作用的信息。染色质免疫共沉淀技术广泛的应用于表观遗传(组蛋白等)分析，转录因子结合位点分析等蛋白质与DNA结合的实验分析中。随着第二代测序技术的逐步完善和成熟，染色质免疫共沉淀结合第二代高通量测序技术(ChlP-seq) 正逐步成为基因调控网络研究中-种非常有效的研究手段。

实验所需设备:
进口1.5ml离心管和进口50ml离心管	冷冻离心机
超声波仪(Soniprep 150)	真空泵
振荡器	静音混合器
磁力架(Dynal, Invitrogen bead separation)	酶标仪
滤膜Miracloth (Calbiochem: Cat.# 475855)
实验所需试剂:
甲醛: Sigma, Cat.# F8775	2M甘氨酸
NaHCO3 ( Sigma)	0.1 M PMSF (-20°C): Amresco, Cat.# M145-5G
100x Protease inhibitors (Pls, -20℃): Roche, Cat.# 11873580001	14.3 M ß-ME (2-mercaptoethano, RT)
20 mg/ml Proteinase K (-20℃): Fermentas, Cat.# EO0491(Takara, D9033)	10 mg/ml RNase A (DNase-free, -20℃):Fermentas, Cat.# EN0531
Tris saturated Phenol:Chloroform:lsoamyl Alcohol (25:24:1) (RT):Sigma-Aldrich, Cat.# P3803	Chloroform (RT)
3 M Sodium acetate (NaOAc, pH 5.2) (4%℃)	20 mg/ml Glycogen (-20℃): Roche, Cat.# 10901393001
70% and 100% Ethanol (RT)	Antibody to be used for ChlP (-20℃)
Protein A/G Dynabeads beads (4℃): Invitrogen, 100.03D	0.5 M EDTA (pH 8.0, 4℃)
5 M LiCl (4℃)	1 M MgClz (4℃)
5 M NaCl (RT)	20% NP40 (Sigma, RT)
10% SDS (RT)	10% Sodium deoxycholate (上海生工分装, 0613, RT)
2 M Sucrose (4℃)	1 M Tris-HCl (pH 6.5 and pH8.0, 4℃)
20% Triton X-100 (Sigma,T8787, 4℃)

实验之前:

在进行水稻染色质免疫共沉淀实验之前，我们首先需要确定两个问题: 1)材料的取样时期和部位，2)需要用到的抗体。

对于水稻而言，过于老化成熟的组织会让甲醛交联过程难以奏效，应尽量避免使用;而选取幼嫩的组织(如发芽后的幼苗，幼嫩的叶片或者幼穗等)进行分析，可以使得甲醛充分浸润，提高交联效率，从而提高实验的成功率。

抗体的选择主要依据实验目的而定，如果是进行表观遗传修饰的分析，则可以根据实验需要选取H3K4，H3K27等抗体;如果是分析转录因子的结合位点，则需要用到转录因子自身的特异性抗体或者与转录因子融合的标签抗体。

实验步骤

实验材料的交联处理(室温);

1.取幼嫩的水稻组织(如发芽后的幼苗，幼嫩的叶片或者幼穗等) 2克左右，将材料剪成尽可能的小的碎片装入50ml离心管中，加入40ml灭菌ddH₂O清洗一遍，完全除去水分，加入1%甲醛交联液30ml, 真空交联15-30min。

注意:

a:如果材料从田间或温室获得，则先用ddH₂O清洗干净，并用面巾纸吸干水分。

b:为防止样品在交联过程中漂浮起来，可以用尼龙布或纱布将样品包好，或者用其他策略确保样品在交联过程中完全浸润在交联液中。

c:交联的时间是实验成败的关键因素之一，交联时间太短，则交联不够充分，难以沉淀到目的片段，交联时间太长，则容易产生过高的背景噪音。因此针对不同的实验条件和组织材料，实验人员应对交联的时间进行摸索和调整。一般而言，当交联的材料变得透明为宜。

2.交联完毕后加入 2ml 2M甘氨酸使甘氨酸终浓度到达0.125 M,混匀之后将样品重新放入真空仪，抽真空5min终止交联反应。

注意：

a:真空泵升压的时候，应保持缓慢匀速，避免箱内压力的剧烈变化。

3.反应结束后在离心管中 加入40ml ddH2O将样品清洗三遍，之后取出样品，放在多层面巾纸之间，尽可能的吸干水分，之后将交联好的样品放入液氮中，置于-70°C保存(也可以直接进行下一步)。

注意：

a:样品取出后要尽可能完全的除去水分，以免影响后续的染色质抽提的过程。

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