本产品是用于定量分析黄曲霉毒素 M₁的酶联免疫试剂盒. 试剂盒包含96 孔所需的材料，包括标准品. 需要实验室配备酶标仪.

检测范围:生乳, 奶粉, 奶酪, 酸奶。

样品前处理
   - 生乳：+2/+8°C冷藏, 离心。
   - 奶粉：稀释。
   - 奶酪：溶剂萃取，过滤，蒸 发 ，还原，离心，稀释。
   - 硬质奶酪 (替代方法)：蛋白酶消化，孵育，离心，过滤，中和，稀释。
   - 酸奶：溶剂提取，离心，蒸发，还原。

检测时间: 75 分钟 (不包括样品前处理时间)。

检出限
   - 生乳: 5 ng/L。
   - 奶酪: 37 ng/Kg。
   - 奶粉: 50 ng/L。
   - 硬质奶酪 (替代方法): 120 ng/Kg。
   - 酸奶: 25 ng/Kg。

特异性
组分	交叉反应率 %
Aflatoxin M1 Aflatoxin M2 Aflatoxin B1 Aflatoxin B2 Aflatoxin G1 Aflatoxin G2	100 16 ＜0.1 ＜0.1 ＜0.1 ＜0.1

1.黄曲霉毒素M1 ELISA检测原理

该测试是在已包被有抗黄曲霉毒素M₁抗体的塑料微孔中进行的。黄曲霉毒素M₁标准溶液和样品被添加到微孔中。在第一次孵育期间，游离黄曲霉毒素M₁分子与抗黄曲霉毒素M₁抗体结合。然后在洗涤步骤中除去任何未结合的物质。用酶耦合物进行第二次孵育，该耦合物覆盖抗体的所有剩余自由结合位点。结合酶活性是通过添加固定量的显色底物来确定的。在第三次培养过程中，酶将无色的色原体转化为蓝色产品。终止液的加入导致颜色从蓝色变为黄色。在450nm处测量吸光度值。溶液颜色的深浅与样品中黄曲霉毒素M1浓度成反比.

2.提供的试剂

提供的试剂
微孔板： 96孔 (12条 ×8 孔)包被有抗黄曲霉毒素 M1抗体。 微孔板可独立拆分，单独使用	1 个盖板：用于在孵育期间覆盖微孔板或孔条。
黄曲霉毒素M1标准品：7 瓶, 每瓶1.5 ml, 浓度分别为 0 ng/L；5 ng/L；10 ng/L； 25 ng/L；50 ng/L；100 ng/L； 250 ng/L。	酶耦合物：1 瓶, 14 ml。
样品稀释液：1 瓶, 12 ml。	提取缓冲液：2 瓶, 每瓶 30 ml。
洗涤缓冲液 20X：1瓶, 50 ml。	发展液：1 瓶, 14 ml。
终止液：1 瓶, 8 ml. 白色盖子。

3.未提供的试剂及耗材

样品前处理

	生乳	奶酪	硬质奶酪	酸奶		生乳	奶酪	硬质奶酪	酸奶
离心机	√	√	√	√	离心管	√	√		√
50ml离心管			√		振荡孵育器			√
纤维过滤器			√		胃蛋白酶(Sigma; cod. P-7000)			√
0.1N HCl			√		pH计			√
0.5N NaOH			√		螺盖玻璃试管		√
蒸发器		√		√	涡旋混合器		√		√
振荡器		√		√	正己烷		√
二氯甲烷		√			甲醇				√
通风橱		√		√	刻度吸管		√
100-1000ul移液器 及配套枪头		√		√

*建议使用冷冻离心机

实验器材

酶标仪： 450nm
50-200 ul微量可调移液器及配套枪头
50-250 ul 多通道微量可调移液器

* 如果检测量小于24孔，可不使用多通道微量可调移液器。

4.使用者注意事项

- 仅供体外诊断使用。
- 某些试剂含有可能被法规（EC）No 1272/2008 确定为危 险物质的溶液。 小心处理试剂，避免接触皮肤，眼睛和黏膜。

5.处理和存储说明

(1)在2 ~ 8℃保存，不能冷冻。
(2) 使用前将所有试剂置于室温下 (2 小时)，注意：达到室温前不要打开微孔板。
(3)将未使用的微孔板放回到装有干燥剂的铝箔袋中。
(4)不要使用过期的产品。
(5)不要混合不同批次的试剂。
(6)请使用使用试剂盒内附带的说明书。
(7)不要更改操作步骤,特别是:
①不要延长孵育时间
②不要在高于25℃和低于18℃的环境中孵育微孔板
③孵育期间不要振荡微孔板。
(8)使用精确的移液器以及配套枪头。
(9)一旦开始实验，不间断完成所有实验步骤。
(10)ELISA结果的可重复性在很大程度上取决于微孔洗涤的效率和均匀性，应始终遵守说明书所描述的程序。
(11)每次加样使用新的加样头，避免交叉污染。
(12)不要让吸头尖端接触微孔或微孔内部的液体。
(13)在所有孵育期间避免阳光直射。不能使用密封胶带覆盖微孔板。

6.样品前处理

6.1.生乳

挤奶后，牛奶必须在48小时内检测

①将样品冷藏，在2-8℃，3000xg离心10分钟。
②分离脂肪，得到脱脂牛奶。
③将脱脂牛奶恢复到室温，直接用于检测。
④在 25–1250 ng/L 的测量范围, 用样品稀释液稀释样品 5倍 (100 μl 样品 + 400 μl 样品稀释液); 为了获得样品中有效的黄曲霉毒素M1浓度，从校准曲线读取的浓度必须乘以 5。

6.2.生牛乳

按照 6.1所描述的步骤进行操作, 可以在不离心 的情况下分析生牛乳。

挤奶后, 必须在24小时内检测。

6.3.奶粉

①称取 10 g 奶粉溶解于100ml蒸馏水中。
② 振荡直至奶粉完全溶解，按照原奶的操作流程，稀释 因子是10。

6.4.奶酪

①称取 2 g 奶酪到螺盖玻璃试管中。
②添加 15 ml 二氯甲烷并振荡提取15分钟。
③过滤悬浮液。
④将3.75ml提取物转移到玻璃管中并在氮气流下在60℃ 蒸发。
⑤ 用750 ul 提取溶液重新溶解残留物，彻底涡旋混合 1分钟 。
⑥添加 750 ul 正己烷，涡旋提取1分钟。
⑦2000xg离心15分钟。
⑧ 移去上层正己烷。
⑨取 50 ul 的甲醇/水相到小试管中，加入200ul稀释缓 冲液并混合均匀，稀释因子是 7.5.

6.5.硬质干酪的替代方法

①细细研磨样品。
②称取 3 g 样品到 50 ml 离心管中。
③添加 30 ml 含有0.2%胃蛋白酶的 0.1N HCl。
④在42℃下振荡培养16小时。④室温下 4500xg 离心 15 分钟 。
⑤将上清液过滤，去除脂肪。
⑥收集10ml滤液，用 2ml 0.5N NaOH中和，确保pH值 在7到7.5之间。
⑦用样品稀释液1:1稀释（1份样品+1份样品稀释液）。
⑧稀释因子是 24。

6.6.酸奶

①称取 1 g 样品添加 5 ml 甲醇。
②充分振荡5分钟。
③5000xg离心5分钟。
④转移0.25ml上层有机相，在缓慢的空气或氮气流下于 40℃蒸发。
⑤将残余物溶于0.25ml样品稀释液中，充分混合1分钟 (涡旋)；静置5分钟。稀释因子是5.

7.实验前准备工作

黄曲霉毒素 M1 标准溶液: 即时使用 (使用前轻轻混匀 ).
样品稀释液: 即时使用.
提取缓冲液: 即时使用.
酶耦合物: 即时使用.
洗涤缓冲液: 用蒸馏水稀释 20倍 (1份洗涤缓冲液+19份蒸 馏水)。注意: 在晶体存在的情况下，将溶液置于室温下 搅拌至完全溶解.
稀释后的洗涤缓冲液在室温下保存24小时，在2 ~ 8°C保 存两周.
发展液:即时使用.
终止液:即时使用.

8.分析过程

试剂盒内所有试剂恢复至室温后使用 (2 小时 ).

(1).预先安排好实验流程，记录好每个标准品、样品的位置， 确保必须按照操作进行。把未使用的微孔条放回原来有干 燥剂的铝薄袋中。
第一次孵育
(2). 添加样品和标准溶液:添加 100 ul 标准品/ 样品到每个微孔中， 轻轻摇动微孔板几秒钟，盖上盖子。
(3). 室温孵育 45 分钟；不要延长第一步孵育时间，不要使用自动振荡器。
(4). 洗板
①倒掉微孔中的液体
②用稀释后的洗涤缓冲液填满整个微孔. 倒掉微孔中的 液体
③在吸水纸上倒扣微孔板并拍打微孔板，吸去微孔板上 多余的水滴
④重复清洗步骤4次
不要让微孔干掉
第二次孵育
(5). 添加100 ul 酶耦合物到每个微孔中
轻轻摇动微孔板几秒钟，盖上盖子
(6).孵育 15 分钟
(7).重复步骤 4。
(8). 添加100ul发展液到每个微孔中，轻轻摇动微孔板几秒钟，盖上盖子。
(9). 室温孵育15分钟。
(10).添加50ul 终止液到每个微孔中，并彻底混合几秒钟。
(11).在450nm 处测定吸光度值，在15分钟内读数。

9.结果计算

   计算每个标准品和样品的平均吸光度值

   将每种标准品和样品的吸光度值除以标准品0（B0） 的吸光度，然后乘以100; 因此，标准0等于100％， 所有吸光度值表示为百分比

在半对数坐标中输入为每个标准品计算的B/Bo值， 并绘制标准曲线

将每个样品的B/Bo值插入校准曲线中得到相应浓度

10.标准曲线示例

11.结果评估

在结果出具之后，有必要验证测定性能。通过将获 得的数据与试剂盒中给出的数据进行比较来执行验证。 如果值超出给定的数据，建议检查试剂盒的失效日期， 吸光度记录的波长以及所用的程序。如果没有出现操作 错误，请联系我们的技术支持.

警告： 在试剂盒不正常的情况下可以进行替换。试 剂盒必须整体保存，并在指定的温度下储存。

12.试剂盒参数

㈠分析参数

Bo 吸光度	≥ 0.7 OD450nm
B/Bo 50%	18-40 ng/L
C.V.	≤ 6%

㈡分析性能

生乳
LOQ	5 ng/L
回收率（加标回收率）*	80-120%
回收率（天然浓度）*	80-140%

13.责任

使用试剂盒评估为阳性的样品必须用确认方法重新测试。对由于不正确使用该试剂盒而导致的任何客户损失以及因结果而采取的任何行动不承担任何责任.

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