兔单克隆抗体制备流程 

服务详情 

步骤	周期	交付材料	询价
1.动物免疫			详情请在线咨询或拨打热线400-066-8086
A.4次动物免疫 B.效价检测 C.PBMC和脾脏淋巴细胞分离 D.RNA提取 E.cDNA制备	8周	4次免疫效价检测数据 4次免疫之后的cDNA
2.构建噬菌体抗体库
A.利用免疫的cDNA，扩增出scFv基因片段，构建M13单链丝状噬菌体展示抗体免疫文库。 B.抗体库质量： （1）scFv抗体片段有效插入率﹥99% （2）抗体库容量达到109次方 C.从文库中随机挑取96个克隆，对其中30个克隆测序，分析scFv抗体片段的多样性和正确率，保证正确率≥80%，另外提供30个克隆用于测序验证。	4-6周	提供质检报告与抗体库 ①完整的项目报告和原始数据，报告需包含实验流程、分析评估实验的主要操作步骤、以及详细的实验结果； ②共30个文库随机克隆的甘油菌和测序引物； ③噬菌体展示抗体免疫文库的Kit（包含文库甘油菌1ml × 10支和文库噬菌粒质粒10 μg）；
3.抗体库筛选
A.筛选方案确定：根据项目实际情况，选择不同的筛选方案，如竞争筛选，固相筛选，液相筛选，细胞筛选，负筛选等筛选方法。 B.淘选： 对抗原蛋白进行SDS-PAGE分析验证，并进行生物素标记；针对生物素化靶点蛋白，利用链霉亲和素预包被的ELISA Plates，淘筛免疫文库；抗原施压法进行2-3轮淘筛，确定充分富集且靶点筛选组的滴度要远高于对照筛选组。 C.结合筛选：选择从Output克隆中，分别挑取单克隆进行阳性克隆鉴定。经培养和Phage Rescue后，进行Monoclonal Phage ELISA检测。 D.测序分析:鉴定出抗原结合强阳性的scFv抗体克隆，测序分析，比对序列制作进化树，选择序列独特的克隆。 E.表达验证：少量表达阳性scFv克隆，利用Soluble ELISA检测对靶点抗原的特异性结合能力。	4-6周	5个以上的特异性克隆
4.抗体表达纯化
A.将抗体基因克隆至真核表达载体。	3-4周	高纯度抗体100-500μg
5.亲和力测定
采用Biacore 测定抗体的亲和力 采用Nicoya LSPR 测定抗体的亲和力 采用Fortebio octet 测定抗体的亲和力	1周 1周 1周	亲和力测定数据
6.抗体人源化（通过自主开发软件AbsYs分析抗体可变区并进行抗体人源化设计。）
A.识别FR、CDR、关键残基、PTMs。 B.通过同源比对，考虑可变区一致性及相似性、关键残基、PTMs、稳定性等因素，选择更好的人源抗体Germline FR作为模板，与CDR 重组，设计初始人源化抗体。 C.分析抗体序列和结构，确定需要回复突变的关键残基，设计不同数量的回复突变VH。 D.将人源化基因克隆至真核表达载体，转染293瞬时表达获得100-500μg 纯化抗体。 E.结合活性及亲和力检测。	6-8周	至少一个人源化抗体（亲和力、表达量与原抗体相当）

兔单抗的应用 

1、在生物标记物开发中，用于癌症的IHC临床诊断与研究，用于蛋白修饰研究领域，如蛋白的磷酸化，以及其他生命科学研究领域。

2、在治疗抗体药物开发中，由于兔单克隆抗体自身的高亲和力，在临床上免去体外亲和力的步骤，减少临床使用量，同时减少了由于大量使用抗体而带来的副作用。

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